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Eficiência reprodutiva aliada a sustentabilidade (parte 2)

Conceitualmente, desenvolvimento sustentável seria capaz de suprir as necessidades da geração atual, sem comprometer a capacidade de atender as necessidades das futuras gerações. É o desenvolvimento que não esgota os recursos para o futuro. ver comentarios

7. Associação das Sondas fluorescentes para a avaliação das membranas espermáticas

 

Como descrito acima, os métodos de coloração empregando corantes fluorescentes aumentaram a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides (ARRUDA et al., 2007), sendo um importante parâmetro de avaliação. As sondas fluorescentes são utilizadas isoladamente ou em combinação para determinar a integridade e a viabilidade celular.

 

A combinação de vários corantes possibilita a avaliação de diversas estruturas celulares simultaneamente. Desta forma, as associações de sondas fluorescentes permitem avaliar concomitantemente mais do que um compartimento da célula espermática em diversas espécies (CELEGHINI et al., 2005)

 

CELEGHINI (2005) preconizando a avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial de uma mesma célula espermática de maneira prática e direta, testou e validou técnicas de associação de sondas fluorescentes. Dentre as técnicas validadas (“PI, FITC-PSA e MitoTracker GreenFM” ou “PI, FITC-PSA e CMXRos” ou “PI, FITC-PSA e JC-1”), a associação PI, FITC-PSA e JC-1 demonstrou ser a melhor, devido a objetividade e simplicidade de aplicação. Ainda, foi a única associação que permitiu separar as populações de células com alto e baixo potencial de membrana mitocondrial.

 

Os espermatozóides são constituídos por vários compartimentos inclusos dentro da membrana plasmática e da membrana mitocondrial. Essas membranas devem permanecer intactas e funcionais para permitir a competência celular, sendo essenciais à proteção, ao funcionamento celular e ao processo de fertilização. Avanços recentes na tecnologia de coloração têm fornecido novos meios de se avaliar a capacidade funcional de espermatozóides em várias espécies. A funcionalidade ou integridade das estruturas dos espermatozóides é monitorada por corantes fluorescentes (sondas fluorescentes ou fluorocromos), as quais possuem a capacidade de se ligar e marcar estruturas específicas das células, permitindo um diagnóstico mais fácil e direto, dependendo de suas características físicas (Arruda & Celeghini, 2003).

 

Apesar do alto custo, elas podem fornecer informações precisas sobre os compartimentos e estado funcional dos espermatozóides, uma vez que a fluorescência é um indicador sensível do estado de certas moléculas, sendo aplicado como um meio de medir mudanças metabólicas dentro de células vivas (CELEGHINI, 2005).

 

Uma variedade de sondas tem sido utilizada na avaliação dos diferentes componentes celulares e a maioria dos testes que foi desenvolvido nos últimos anos com esse objetivo, permite analisar diferentes aspectos da função espermática como a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial.

 

A integridade da membrana plasmática é essencial para a manutenção da viabilidade espermática (PAPAIOANNOU et al., 1997), por ser responsável pelo mecanismo de manutenção de equilíbrio osmótico, atuando como uma barreira seletiva entre os meios intra e extracelular. Danos nesta estrutura podem levar a perda da homeostase com posterior morte celular e, segundo SILVA & GADELLA (2006), in vivo, um espermatozóide com a membrana plasmática afuncional torna-se incapaz de realizar a fertilização.

 

Por ser um corante muito estável, o PI tem apresentado êxito nos resultados tanto com o sistema de citometria de fluxo para contagem de células quanto em microscopia de epifluorescência (CELEGHINI, 2005), corando em vermelho o núcleo de células com membrana plasmática lesada (PAPAIOANNOU et al., 1997) devido à sua afinidade ao DNA.

 

Além disso, esta sonda vem se destacando em pesquisas pela sua facilidade de aplicação da técnica e eficiência na avaliação da integridade da membrana, seja isoladamente ou associada a outro corante fluorescente para avaliar membrana plasmática (ARRUDA et al., 2007).

 

O acrossomo é uma grande organela preenchida com enzimas hidrolíticas. A ligação inicial do espermatozóide com a zona pelúcida do oócito tem como objetivo a reação acrossomal, resultando na liberação e ativação das enzimas acrossomais (SILVA & GADELLA, 2006) que são fundamentais para que ocorra a fecundação. Portanto, a avaliação da integridade acrossomal antes dos processos de reprodução assistida vem sendo cada vez mais empregada (SILVA e GADELLA, 2006), visto que a integridade do acrossoma é um aspecto fundamental para a fertilização.

 

A FITC-PSA é utilizada para avaliar integridade do acrossomo em diversas espécies (ARRUDA et al., 2007).

 

As mitocôndrias espermáticas estão localizadas na peça intermediária do espermatozóide e sua principal função é realizar a fosforilação oxidativa e produzir ATP. A membrana mitocondrial interna é o local de produção dessa energia metabólica, sendo essencial para o batimento flagelar, possibilitando a propulsão (Celeghini, 2005; Silva & Gadella, 2006; SOUSA, 2007) e a penetração do espermatozóide no oócito. Portanto, a mitocôndria tem papel fundamental na motilidade e, segundo MARCHETTI et al. (2004), a análise da função mitocondrial pode oferecer uma maneira de acessar a motilidade espermática.

 

O potencial de membrana mitocondrial interno é gerado pela cadeia respiratória e coordena a síntese de ATP mitocondrial. A capacidade para monitorar mudanças no potencial de membrana em mitocôndrias dentro das células pode ser crucial para a interpretação de mudanças na fisiologia celular em várias situações experimentais (Duchen et al., 1993 citado por CELEGHINI, 2005).

 

 

8. RNA espermático e fertilidade

 

Inúmeros estudos têm demonstrado que o espermatozóide transporta não apenas o DNA paterno, mas também moléculas de RNAs codificantes e não codificantes, tais como RNAs antissenso (aRNA) e microRNAs (miRNA) (CUMMINS, 2001; LALANCETTE et al., 2008). Dada a inabilidade do espermatozóide em sintetizar RNAs, supõe-se que as moléculas de RNA nele encontradas sejam remanescentes da espermiogênese (GILBERT et al., 2007).

 

Até o momento, pouco se sabe sobre o transcriptoma do espermatozóide, mas sua origem faz com que o RNA espermático apresente algumas peculiaridades: estudos de microarranjos de DNA mostram que se trata de um transcriptoma pequeno (embora não se saiba com precisão seu tamanho), composto por fragmentos menores do que 1 Kb (GILBERT et al., 2007). Como não há atividade translacional em espermatozóides, não são encontrados RNAs ribossômicos. As células espermatogênicas produzem grande quantidade de RNA poliadenilado (aproximadamente 30% do RNA total) (LALANCETTE et al. col., 2008). A maioria destas moléculas é estável, sendo preservada até o final da espermiogênese, estocadas no citoplasma (PAPAIOANNOU & NEF, 2010). O RNA encontrado nas espermátides sofrem deadenilação [remoção da cauda de poli(A)], processo comumente encontrado em células sem atividade translacional. Como o processo de deadenilação é incompleto, moléculas de RNA com e sem a cauda de poli(A) são encontradas nos espermatozóides (GILBERT et al., 2007). A população de RNA espermático não representa vias metabólicas específicas, mas sim uma gama ampla de funções celulares básicas (GILBERT et al., 2007).

 

Inicialmente, a maioria dos transcritos espermáticos foi associada ao desenvolvimento do espermatozóide; entretanto, com o surgimento das tecnologias de alto rendimento como microarranjos de DNA e a detecção de transcritos específicos de espermatozóides em óvulos fertilizados, a diversidade funcional do RNA de espermatozóides tem crescido (OSTERMEIER  et al., 2004). Atualmente, tem sido conferido aos RNA espermático papel na qualidade do sêmen, fertilização e desenvolvimento embrionário (LALANCETTE et al., 2008).

 

Em bovinos, uma análise por microarranjos de DNA de espermatozóides de animais com taxas contrastantes de retorno (alta fertilidade versus baixa fertilidade) em lâminas contendo 24K sondas bovinas indicou um total de 415 transcritos diferencialmente expressos entre as duas classes de animais, dos quais 211 são pelo menos 2 vezes mais expressos em touros de alta fertilidade e 204, em touros de baixa fertilidade (FEUGANG et al., 2010). Segundo os autores, espermatozóides de animais com baixa fertilidade são deficientes em transcritos associados ao espaço extracelular, transportadores, fatores de transcrição e maquinaria de tradução, enquanto as amostras de alta fertilidade careciam de transcritos do ciclo celular, mas apresentavam altas concentrações de transcritos associados com transporte celular, atividade de receptores e espaço extracelular.

 

Como visto, a tecnologia de microarranjos de DNA tem contribuído muito para o conhecimento dos mecanismos moleculares que envolvem a espermatogênese e a etiologia genética da infertilidade em machos. Esta tecnologia de alto rendimento tem sido amplamente utilizada em estudos de perfil de expressão gênica global em espermatozóides humanos (OSTERMEIER et al., 2002), murinos e bovinos (FEUGANG et al., 2010). Embora os microarranjos de DNA tenham acurácia comprovada em estudos de expressão gênica global, a detecção se limita aos genes presentes nas lâminas, o que torna esta tecnologia não muito adequada para estudos de tecidos ainda não bem caracterizados como os espermatozóides (LALANCETTE et al., 2008), limitando o estudo destes transcriptomas. Além do mais, os microarranjos de DNA são sensíveis apenas para a detecção de transcritos de média ou alta abundância. Estas limitações podem ser superadas com o uso de seqüenciamento de próxima geração para estudos de transcriptomas.

 

O sequenciamento de transcriptomas requer a conversão de RNA mensageiro em moléculas de cDNA dupla-fita, cujo processamento leva à construção de uma biblioteca de cDNA fita simples, substrato para reações de PCR em emulsão que antecedem o sequenciamento; este, por sua vez, pode se dar por pirosequenciamento (plataforma 454/ Roche), por síntese (Illumina/ Solexa) ou por ligação (SOLiD/ ABI).

 

A característica ímpar do seqüenciamento de alto rendimento de transcriptomas é a versatilidade do resultado gerado, que pode ser analisado de forma a esclarecer simultaneamente dados de níveis de expressão gênica, de estrutura do locus genômico e variações de sequência presentes em um determinado locus (isto é, single nucleotide polymorphism – SNP). Como visto, por causa de sua origem e das peculiaridades da espermatogênese, o RNA de espermatozóides pode ser visto não apenas como um remanescente deste processo que escapa da perda citoplasmática dos últimos passos da espermiogênese, mas também como um marcador de qualidade da espermatogênese e fertilidade (LALANCETTE et al., 2008). De fato, o estudo dos transcritos presentes em espermatozóides tem sido considerado uma abordagem não invasiva para a análise de defeitos genéticos na espermatogênese humana (YATSENKO et al., 2006). Embora a função deste RNA não tenha sido totalmente esclarecida, a identificação de moléculas de RNA no espermatozóide maduro pode ser de grande importância para o melhor entendimento dos processos de espermatogênese e fertilização (LALANCETTE et al., 2008). Mais ainda, o perfil de expressão gênica dos espermatozóides pode tanto servir como uma ferramenta diagnóstica para determinação da fertilidade de machos como possuir um valor prognóstico para fertilização e desenvolvimento embrionário (FEUGANG et al., 2010).

 

 

9. Sexagem de espermatozóides na inseminação arficial (IA) e na produção in vitro de embriões (PIVE)

 

Segundo dados da Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões, no Brasil, são transferidos 270 mil embriões bovinos por ano, o que corresponde a 86,60% dos embriões transferidos mundialmente, atingindo o Brasil o primeiro lugar na aplicação dessa biotecnologia. As raças predominantemente exploradas são as raças zebuínas, chegando a 94% da produção de embriões no Brasil. A técnica de produção in vitro de embriões, embora apresente algumas limitações em seu uso, tornou-se, em nosso País, uma realidade comercial que movimenta uma cadeia produtiva de faturamento anual superior a 70 milhões de reais. Uma das limitações técnicas, todavia, é que o sistema de cultivo desvia a proporção dos sexos para o masculino. As empresas e cooperativas tem tentado contornar esse desvio da proporção sexual em favor do sexo masculino no sistema de cultivo da PIVE utilizando espermatozóides sexados pelo método de citometria de fluxo.   

 

Em 2004 o Brasil entrou no rol dos países que contam com a produção e comercialização de espermatozóides sexados em um cenário onde 9% das fêmeas em idade de reprodução são inseminadas de acordo com a Associação Brasileira de Inseminação Artificial. Nesse mesmo cenário o aumento de rebanhos submetidos a Programas de Melhoramento Genético e Cruzamento Industrial, desde 1989, permitiu que as vendas de sêmen congelado aumentassem mais de 300% em 10 anos (ASBIA, 2010). Dos 10,4 milhões de doses comercializadas em 2010, 58,32% foram de genética nacional.       Além disso, a sexagem de espermatozóides, associada a programas de IA possui um mercado potencial atrativo para bovinos já que o Brasil possui o maior rebanho comercial bovino do mundo (cerca de 200 milhões de cabeças). O número crescente de rebanhos submetidos a Programas de Melhoramento Genético e Cruzamento Industrial permite avaliar que, atualmente, as vendas de sêmen mantenham-se em um patamar acima de 10 milhões de doses por ano.

 

          O setor de inseminação do País mantém-se em crescimento, segundo a análise de algumas empresas da área, devido, inclusive, à comercialização de sêmen sexado com um aumento médio de 10% ao ano. O setor de corte exerce influência nesse resultado, particularmente no cruzamento industrial, pela continuidade do crescimento do corte apoiado pela Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) e pela falta de matrizes no mercado.

 

Entretanto, esse atrativo mercado brasileiro, a exemplo de outros países, talvez não consiga eliminar os fatores que limitaram a eficiência da técnica de sexagem disponível comercialmente, a citometria de fluxo.

 

Em bovinos, apesar dos espermatozóides sexados por essa técnica, aparentemente não diminuírem, de forma significativa, a taxa de prenhez até os 60 dias de gestação, pode-se constatar uma diminuição nas taxas de prenhez ao nascimento. Resultados de campo de vários países demonstram que, na IA, a baixa taxa de prenhez após os 60 dias da IA (média de 30%) pode igualar ou diminuir o número de fêmeas nascidas a cada 100 inseminações quando comparado com a IA utilizando sêmen convencional do mesmo touro (taxa média de prenhez de 70%). Na PIVE, também ocorre baixa taxa de prenhez (média de 27%) o que pode acarretar a produção de número igual ou inferior de fêmeas a cada 100 oócitos fecundados quando comparado com o sêmen convencional, o qual permite 40% de prenhez. No Brasil, levantamento realizado pela nossa equipe de pesquisa comparando dados de campo após a utilização do “sêmen sexado” e sêmen convencional, indicou o cenário a seguir:

 

1) Na IA com “sêmen sexado”, a taxa de prenhez foi 15% menor e nasceram 10% mais fêmeas, resultando aumento de 40% no custo da IA;  

 

3) Na PIVE, o “sêmen sexado” produziu taxa de nascimento 20% menor, o mesmo número de fêmeas nascidas que o sêmen convencional, resultado aumento de 10% no custo da PIVE.

 

             

 

O genoma paterno e o desenvolvimento embrionário

 

A diminuição nas taxas de nascimento pode ser explicada por estudos realizados pela nossa equipe com a colaboração do grupo de pesquisa em Embriologia Molecular do Instituto Nacional de Investigación y Tecnologia Agraria y Alimentaria (INIA, Madrid, Espanha). Eles indicam que os riscos associados com o processo de sexagem por citometria de fluxo (coloração, exposição à luz ultravioleta, alta pressão, campo elétrico) podem ser responsáveis por danos no DNA (ácido desoxirribonucleico que é um composto orgânico cujas moléculas contêm as instruções genéticas que coordenam o desenvolvimento e funcionamento de todos os seres vivos) dos espermatozóides que aparentemente não impedem o desenvolvimento in vitro do zigoto, mas podem ter efeitos na expressão dos genes, contribuindo para as altas taxas de perda embrionária nos períodos de 60 a 90 dias de gestação. Esses efeitos deletérios, também podem se manifestarem apenas nos estágios mais tardios de desenvolvimento. Danos no DNA estão relacionados com alterações no padrão de expressão dos genes e falhas na gestação.

 

O espermatozóide é o veículo que entrega o material genético paterno para o óvulo, sendo esta entrega de material genético crucial para a embriogênese.

 

Existe uma extensa comunicação entre o espermatozóide apto para a fecundação e o óvulo. Muitas estruturas, organelas e moléculas presentes no espermatozóide parecem ser essenciais para a realização de uma fecundação normal e para o desenvolvimento embrionário. Espermatozóides com alterações no DNA resultam em falha ou atraso na fecundação e no desenvolvimento embrionário. Entretanto, o espermatozóide com o DNA danificado pode ser capaz de fertilizar um oócito, mas acaba resultando em embrião de baixa qualidade.

 

Durante o processo de sexagem os espermatozóides estão expostos a muitos riscos potenciais os quais podem ser responsáveis por alguns efeitos deletérios, como alterações no DNA ocasionadas pelo corante Hoesch 33342, alterações no padrão de motilidade espermática, viabilidade reduzida, aceleração da reação acrossomal e aumento na proporção de células que sofreram capacitação espermática. Portanto, a baixa qualidade e a baixa fertilidade dos embriões produzidos in vitro utilizando sêmen sexado, podem ser conseqüências desses danos. Nossos estudos relataram anormalidades em termos de abundância de produtos da expressão dos genes relacionados aos processos de reconhecimento da gestação e formação da placenta e metabolismo celular, em embriões produzidos in vitro com espermatozóides sexados por citometria de fluxo. Isso pode levar a desvios que afetam o desenvolvimento embrionário e a ocorrência de fenômenos patológicos que fazem com que os embriões estejam desprovidos do potencial para sustentarem a prenhez.

 

Em bovinos, a seleção do sexo tem valor econômico e genético significativos quando está associada a Inseminação Artificial (IA) e a produção in vitro de embriões PIVE, nos sistemas onde a produtividade é favorecida pela progênie de um dos sexos (SPLAN et al., 1998; HOHENBOKEN, 1999) e desde que a metodologia utilizada não diminua a eficiência reprodutiva (WEIGEL, 2004). Assim, aplicabilidade comercial da sexagem dos espermatozóides depende do estabelecimento de uma metodologia que além de ser compatível com o processo de congelação, minimize a perda de espermatozóides durante o processo e não reduza o poder fecundante dos mesmos. Considerando estes aspectos, é necessário avaliar a qualidade não somente em relação à acuidade de sexagem, mas também no que diz respeito à viabilidade dos espermatozóides após a descongelação das doses de sêmen congelado enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y (HOSSEPIAN DE LIMA, 2007).

 



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