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Criopreservação de Embriões e Oócitos
Por: Elen Pyles

Uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de ovócitos e embriões produzidos in vivo ou in vitro não transferidos é a utilização de técnicas de criopreservação. Com o advento da produção in vitro de embriões, e por estes serem mais sensíveis às crioinjúrias, muitos esforços têm sido empregados no sentido de se aprimorar o armazenamento dos mesmos. Por isso, um dos grandes desafios para a criobiologia reprodutiva tem sido desenvolver um método eficiente de criopreservação de ovócitos e embriões. ver comentarios

INTRODUÇÃO

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Uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de ovócitos e embriões produzidos in vivo ou in vitro não transferidos é a utilização de técnicas de criopreservação. Com o advento da produção in vitro de embriões, e por estes serem mais sensíveis às crioinjúrias, muitos esforços têm sido empregados no sentido de se aprimorar o armazenamento dos mesmos. Por isso, um dos grandes desafios para a criobiologia reprodutiva tem sido desenvolver um método eficiente de criopreservação de ovócitos e embriões.
É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa preservação, os quais possam minimizar os danos ultra-estruturais causados às células em decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua viabilidade após a descongelação. Apesar de muitos embriões parecerem viáveis após a criopreservação e remoção do crioprotetor, com a maioria de suas células intactas, os índices de gestação obtidos após as transferências são consideravelmente menores que aqueles obtidos com a transferência de embriões transferidos a fresco.
Várias técnicas têm sido testadas utilizando-se ovócitos em diferentes estágios de maturação, diferentes tipos e concentrações de crioprotetores, temperatura de exposição aos crioprotetores, curvas de resfriamento, estabilizadores do citoesqueleto e protocolos de descongelação e remoção dos crioprotetores.

REVISÃO DA LITERATURA

1. AGENTES CRIOPROTETORES E PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO
A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de quiescência, tornando possível a conservação de células e tecidos por tempo indeterminado. O primeiro sucesso desta técnica foi mencionado por Whittingham (1971), utilizando embriões de camundongos.
Um dos mais importantes princípios da criopreservação reside na necessidade de se remover o máximo possível de água das células antes de se proceder a sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, grandes cristais de gelo se formam lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a remoção demasiada de água das células também pode ser deletéria (Seidel Jr., 1986).
Independentemente da técnica, todos os métodos de criopreservação necessitam de crioprotetores, os quais são divididos em duas categorias: intracelulares (como dimetilsulfóxido ? DMSO, propanodiol, glicerol, etilenoglicol, etc) e extracelulares (como trealose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona ? PVP, etc) (Niemann, 1991). Essas duas classes de crioprotetores são usadas separadamente ou associadas para diferentes tipos de protocolo de criopreservação (Im et al., 1997; Young et al., 1998).
Seidel Jr. (1986) considera que o mecanismo de ação dos crioprotetores baseia-se principalmente na promoção do abaixamento do ponto de solidificação da solução na congelação. Isto é benéfico por várias razões, mas principalmente porque promove um maior tempo para a desidratação da célula, diminuindo a formação de cristais de gelo intracelulares. Uma segunda função dos crioprotetores parece ser sua interação com a membrana celular, exercendo uma ação estabilizadora durante as mudanças de um estado relativamente líquido para um estado sólido e, talvez até mais importante, na volta para o estado líquido na descongelação.
O etilenoglicol (EG) tem sido utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de ovócitos e embriões em várias espécies, devido principalmente ao seu baixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores, proporcionando rápida entrada e saída na célula durante o período de equilíbrio e rehidratação, respectivamente, o que permite a rehidratação direta após a descongelação (Voelkel e Hu, 1992). O EG possui ainda a vantagem de ser menos tóxico do que outros crioprotetores (Cetin e Bastan, 2006).
Apesar dos efeitos benéficos do crioprotetor, não existe uma técnica de criopreservação celular que permita 100% de sobrevivência após a congelação e descongelação, mesmo utilizando-se curvas de resfriamento e aquecimento consideradas ótimas. Existem duas razões para justificar as falhas na ação dos crioprotetores: primeira, a toxicidade do crioprotetor limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (Fahy, 1986). Segunda, os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas (Arnold et al., 1983). George et al. (1995) relatam que a adição de 20% de soro fetal bovino (SFB) ao meio de criopreservação de ovócitos de camundongos previne o endurecimento da membrana pelúcida, minimizando os efeitos tóxicos dos crioprotetores.

2. INFLUÊNCIA DO ESTÁGIO DE MATURAÇÃO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS
Quanto maior o volume do ovócito, maior o tempo necessário para que a célula atinja o equilíbrio osmótico em presença de crioprotetores. Isto explica o motivo da criopreservação de ovócitos bovinos ser difícil de ser realizada com sucesso e resultar em baixas taxas de produção de blastocistos após o aquecimento, FIV e cultura in vitro, pois devido ao seu grande tamanho é mais difícil para a água e os crioprotetores se moverem através da membrana plasmática (Seidel Jr., 2006). O resfriamento pode também resultar em diminuição dos índices de fertilização causada pela exocitose prematura dos grânulos corticais e o endurecimento da zona pelúcida (Fukui et al., 1995).
Os ovócitos respondem à criopreservação diferentemente dependendo do estágio de maturação nuclear. Ovócitos em estágio de vesícula germintativa parecem ser mais sensíveis à criopreservação do que ovócitos em metáfase II. A razão para a maior sensibilidade natural dos ovócitos bovinos imaturos para a criopreservação é desconhecida (Men et al., 2002; Diez et al., 2005).
Em adição aos efeitos negativos, os processos bioquímicos no interior dos ovócitos também podem ser afetados pela criopreservação, assim influenciando negativamente a maturação citoplasmática (Men et al., 2002). Sugere-se também que os processos de congelação e descongelação podem alterar as propriedades físico-químicas dos lipídeos intracelulares. Os lipídeos intracelulares são fonte de energia para o ovócito e constituem material para a membrana citoplasmática do futuro embrião (Didion et al., 1990).

3. USO DE ESTABILIZADORES CITOESQUELÉTICOS DURANTE A CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS E EMBRIÕES
Tanto as baixas temperaturas a que são submetidos os ovócitos, como a adição de substâncias crioprotetoras modificam a organização dos microfilamentos de actina, e assim, alterações irreversíveis de outros componentes celulares podem ocorrer como a liberação precoce das enzimas dos grânulos corticais, previnindo completamente a fertilização ou incompletamente o bloqueio à polispermia, ambos levando à diminuição nas taxas de clivagem após a inseminação (Albarracín et al., 2005).
Isachenko et al. (1998) utilizaram a citocalasina-B para estabilizar componentes citoesqueléticos, tornando-os mais flexíveis e menos susceptíveis à injúrias durante o estresse osmótico da congelação de ovócitos de porcas, demonstrando o efeito reversível da droga. O tratamento das células com citocalasina-B faz com que a membrana plasmática se torne menos rígida e mais elástica e, assim, os microfilamentos não se rompem durante manipulações prolongadas.

4. CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS E EMBRIÕES
A partir desses conceitos preliminares de criopreservação, duas técnicas podem ser opções viáveis para a preservação de ovócitos e embriões: o método tradicional de congelação lenta e a vitrificação (Hochi et al., 1996).
As substâncias crioprotetoras vêm sendo utilizadas em diversas concentrações e combinações. Tais substâncias são adicionadas às soluções em um único passo ou paulatinamente e os ovócitos e embriões criopreservados com diferentes curvas de abaixamento da temperatura, sendo em alguns casos mergulhados diretamente no nitrogênio líquido a partir da temperatura ambiente. Da mesma maneira, a temperatura de aquecimento tem variado de 20 a 37°C em banho-Maria ou ao ar e a retirada do crioprotetor realizada em um ou mais passos (Landim-Alvarenga, 1995).

4.1. Congelação
Com relação aos avanços obtidos na criobiologia nos últimos anos, muito poucos protocolos de congelação de ovócitos e embriões têm sido colocados na prática. Na maioria das vezes é utilizado o método tradicional de congelação (Palasz e Mapletoft, 1996).
Denominou-se curva clássica de congelação os procedimentos descritos por Whittinghan (1980) para conservação de embriões mamíferos em baixas temperaturas: 1) equilíbrio no crioprotetor; 2) envase; 3) colocação das palhetas no aparelho congelador; 4) ?seeding?; 5) resfriamento de -0,3 a -0,5°C por minuto até -32°C; 6) imersão e conservação no nitrogênio líquido; 7) descongelação; 8) remoção do crioprotetor.
Os procedimentos adotados por Niemann (1991) para congelação de embriões bovinos foram: 1) adição de 1,4M glicerol feita em única etapa à temperatura ambiente, com período de equilíbrio de 20 minutos; 2) envase dos embriões em palhetas de 0,25mL, com três colunas de meio, separadas por duas colunas de ar, permanecendo o embrião na coluna central; 3) transferência das amostras para o banho de álcool, à temperatura de -7ºC, realizando-se o ?seeding?; 4) após 5 minutos da indução da cristalização, a temperatura foi decrescida à 0,3°C por minuto, até atingir -28°C; 5) de -28°C à -35°C, a taxa de resfriamento foi de -0,1°C por minuto, sendo as palhetas mergulhadas em nitrogênio líquido.
Porém, Schneider e Mazur (1984) demonstraram uma adequada curva de resfriamento no processo de congelação de embriões bovinos que propicia uma eficiente remoção da água intracelular, assim descrita: 1) após a adição do crioprotetor e envase, as amostras devem ser transferidas para o recipiente do congelador previamente resfriado à temperatura próxima de -5°C para soluções a 1M glicerol e -7°C, para soluções a 1,5M; 2) as amostras devem ser equilibradas à temperatura do ?seeding? por 5 a 10 minutos; 3) deve ser realizado o ?seeding?; 4) a temperatura do ?seeding? deve ser mantida por mais 10 minutos, para permitir equilíbrio da solução, inicialmente cristalizada; 5) as taxas de resfriamento devem estar entre -0,3 a -0,5°C por minuto até atingir temperaturas entre -30 a -40°C. É aconselhado manter as amostras no equipamento de congelação por 15 a 30 minutos antes de imergi-las em nitrogênio líquido (-196ºC), quando adotadas elevadas taxas de resfriamento.
Com a introdução da sacarose nos procedimentos de diluição de substâncias crioprotetoras intracelulares, as técnicas tornaram-se mais rápidas e seguras, pois a sacarose atua como um tampão osmótico, mantendo constante a concentração do meio extracelular, regulando a velocidade de entrada da água e saída do crioprotetor do embrião, evitando o choque osmótico. Somente após o emprego da sacarose e das palhetas francesas foi possível realizar o método ?one-step? de descongelação (Niemann, 1991). Este método permite a transferência direta dos embriões para as receptoras na mesma palheta no qual foram congelados. Isto simplificou significativamente a técnica, reduzindo o tempo requerido para preparar os embriões para serem transferidos e eliminando a necessidade de equipamentos especiais (Palasz e Mapletoft, 1996).
As taxas de sobrevivência após a descongelação apresentam variações segundo a qualidade pré-congelação de embriões bovinos. Os autores afirmam que elevados índices de sobrevivência somente são possíveis selecionando-se rigorosamente, através da morfologia, os embriões para congelação (Kennedy, 1986).

4.2 Vitrificação
A vitrificação é um protocolo de criopreservação baseado na desidratação do embrião ou ovócito através da sua breve exposição à soluções com alta concentração de crioprotetor seguida da imersão direta em nitrogênio líquido. Devido à alta concentração de crioprotetor e à rápida curva de congelação o sistema solidifica-se sem que ocorra cristalização (Martino et al., 1996b).
Na reprodução assistida a vitrificação é uma técnica promissora, sendo um procedimento simples, menos oneroso e que requer menos tempo do que os métodos de congelação (Dobrinsky, 2002; Kuleshova e Lopata, 2002).
Comparando-se as duas técnicas, a congelação tradicional é uma tentativa de manutenção do equilíbrio entre danos osmóticos e tóxicos utilizando baixas concentrações de crioprotetores e controlando a formação de gelo através da congelação do meio extracelular e desidratação do embrião. Em contraste, a estratégia de vitrificação é mais radical, pois é baseada na eliminação total da formação de gelo. Porém, as altas concentrações de crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos. Por outro lado, a alta velocidade de resfriamento e aquecimento resulta em uma rápida passagem através da temperatura perigosa ao redor de 0ºC, o que minimiza os danos causados pelo resfriamento que prejudica predominantemente estruturas ricas em lipídeos (Vajta, 1997).
As soluções de vitrificação, assim como as soluções usadas para a congelação lenta, contêm um crioprotetor, vários sais e usualmente uma ou mais macromoléculas (O?Neil et al., 1997). Para protocolos de vitrificação, o EG em associação com outros crioprotetores não permeáveis tem se tornado a solução mais comumente utilizada (Hochi et al., 1996; Martino et al., 1996a e b).

4.2.1. Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25ml
Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de inseminação de 0,25ml. Contudo, essas palhetas limitam o padrão máximo de congelação e aquecimento a 2000ºC/min (Vajta et al., 1998).

4.2.2. Método OPS ? Open Pulled Straw
A técnica chamada de Open Pulled Straw (OPS) foi desenvolvida por Vajta et al. (1997), originalmente desenvolvida para embriões de bovinos e de porcos, e, com sucesso, modificada para a vitrificação de ovócitos bovinos.
Nesta técnica, as palhetas francesas de inseminação de 0,25ml são esticadas e cortadas ao meio, produzindo duas OPS. O envasamento é realizado por efeito capilar simples. Cerca de 1 a 2ml do meio de vitrificação contendo os ovócitos ou embriões é introduzido na extremidade estreita da palheta, a qual é imediatamente submersa no nitrogênio líquido. A coluna líquida solidifica-se imediatamente, sem que haja a dispersão da solução, o que é comum se forem utilizadas palhetas de tamanho original (Vajta et al., 1998). Neste método a taxa de resfriamento é de 20.000ºC/min (Kuleshova e Lopata, 2002).
O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido. O meio vitrificado volta ao estado líquido dentro de 1 a 2 segundos. Imediatamente após, os ovócitos ou embriões flutuam no meio de aquecimento (Vajta et al., 1998).
São descritas taxas de até 25% de produção de blastocistos a partir de ovócitos vitrificados (Cetin e Bastan, 2006).
É difícil determinar se a curva lenta de congelação, com as possíveis injúrias causadas pela cristalização ou a vitrificação, com os possíveis danos tóxicos e osmóticos seria a técnica mais apropriada para criopreservação de ovócitos bovinos (Hamano e Kuwayama, 1992).
Baseado no trabalho rápido, simples, seguro e de baixo custo e os padrões de sobrevivência e desenvolvimento descritos, a técnica OPS é considerada também no presente estágio como um considerável avanço na criobiologia reprodutiva, como um alto potencial de impacto nas futuras pesquisas e aplicação comercial de produção in vitro de embriões bovinos (Vajta et al., 1997).

5. CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES MICROMANIPULADOS
Muitas pesquisas têm sido realizadas para a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro, pois estes são mais sensíveis à criopreservação e tem as taxas de gestação significativamente menores após a transferência quando comparado com os embriões produzidos in vivo também criopreservados (Dobrinsky, 2002).
Nos últimos anos, várias tentativas têm sido feitas para aumentar as taxas de sobrevivência desses embriões após a criopreservação. Duas linhas de pesquisa têm sido seguidas: a) modificações nos sistemas de cultivo in vitro para melhorar o meio embrionário para que os embriões possam resistir melhor às condições do processo de criopreservação; b) desenvolvimento de uma técnica de criopreservação específica adaptada para embriões produzidos in vitro (Martínez et al., 2002).
Há indicações de que o sistema de cultura e a composição do meio podem afetar a qualidade do embrião. Vários estudos têm mostrado que a qualidade do ovócito é o maior fator que determina a produção de blastocisto, o ambiente de cultura in vitro ao qual os embriões são expostos após a fertilização é a chave determinante da qualidade do blastocisto. Portanto, a habilidade dos embriões produzidos in vitro em sobreviver à criopreservação depende de sua qualidade, a qual pode ser afetada pelas condições de cultura (Pereira et al., 2005).
Embriões bovinos produzidos in vitro possuem maior conteúdo lipídico. Embriões cultivados in vitro na ausência de SFB são mais criotolerantes que aqueles cultivados em meio contendo soro. A redução do conteúdo lipídico citoplasmático dos embriões com fenazina etosulfato (PES), um composto que oxida NADPH, promove criotolerância aos embriões bovinos cultivados na ausência de soro (Seidel Jr., 2006).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O grau de aproveitamento dos ovócitos e embriões criopreservados e descongelados depende de técnicas de tratamento que não produzam danos que os inviabilizem. Verifica-se, no entanto, que quando o manejo requer que os embriões bovinos sejam criopreservados antes da transferência para as receptoras, as técnicas correntes de criopreservação sempre causam perdas de viabilidade.
É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa preservação de óvócitos e embriões, os quais possam minimizar os danos causados aos mesmos em decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua viabilidade pós-aquecimento.


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