Bioembryo - Biotecnologia da reprodução animal

Cadastre-se e receba nossas novidades!

Artigos

Aspiração Folicular In Vivo: Metodologia, Eficiência e Sequelas
Por: Marcelo M. Seneda

A obtenção de oócitos disponíveis para produção in vitro de embriões (PIV) ocorre através da técnica de aspiração folicular transvaginal, ou OPU (ovum pick up). Há mais de uma década a OPU tem sido a melhor opção para a recuperação de oócitos in vivo na espécie bovina[1]. ver comentarios

Clique para ampliar

Marcelo M Seneda
Departamento de Clínicas Veterinárias - Centro de Ciências Agrárias
UEL, Londrina, PR, 86051-990 mseneda@uel.br


1. Introdução

A obtenção de oócitos disponíveis para produção in vitro de embriões (PIV) ocorre através da técnica de aspiração folicular transvaginal, ou OPU (ovum pick up). Há mais de uma década a OPU tem sido a melhor opção para a recuperação de oócitos in vivo na espécie bovina[1].
Anterior ao advento da ultra-sonografia, vários procedimentos foram propostos, e a laparoscopia transvaginal [2] ou paralombar [3] permitiram o aproveitamento de oócitos de animais vivos. Consistindo de um procedimento cirúrgico menos cruento que a laparatomia, a laparoscopia permitiu a recuperação de oócitos em novilhas [4], e mesmo em bezerras de apenas 3 semanas de idade [5]. Apesar das perspectivas promissoras, limitações para a laparoscopia foram listadas por Looney et al. (1994)[6]. Estes autores comentaram ser a técnica trabalhosa, além da ocorrência de fibroses e aderências ovarianas após sua realização. Hinrichs et al. (1990) [7] propuseram a recuperação de oócitos através da técnica de colpotomia, na qual a punção dos ovários é viabilizada por meio de uma incisão no fundo de saco vaginal. Mas os riscos de peritonite e evisceração através da incisão vaginal limitaram a expansão deste procedimento.
Valendo-se das possibilidades da ultra-sonografia, Callesen et al. (1987) [8] relataram pela primeira vez o uso desta técnica para a obtenção de oócitos bovinos, através da punção ovariana transcutânea na região paralombar. Um ano depois, Pieterse et al.(1991) [9], descreveram a aspiração folicular transvaginal através da ultra-sonografia, que tornou viável o aproveitamento de oócitos bovinos, sem as limitações dos procedimentos existentes até então. Após avaliações iniciais, a técnica mostrou-se simples e aplicável, viabilizando a obtenção repetida de oócitos destinados aos procedimentos in vitro, inclusive com citações de aumento no número de folículos após várias semanas de aspirações foliculares [15]. Outro aspecto favorável da OPU/PIV é a possibilidade de se conseguir embriões mesmo em fêmeas gestantes. Isto é possível porque os ovários mantêm sua atividade durante a prenhez, tornando viável a recuperação dos oócitos. Se a técnica de OPU for bem conduzida, não há qualquer risco à gestação e pode-se realizar a aspiração folicular até o terceiro mês de prenhez, ou até o período em que o médico veterinário conseguir manipular os ovários sem que seja necessária uma tração vigorosa.
A possibilidade de obtenção de embriões em situações de infertilidade extra-ovariana motivou vários grupos à realização do procedimento, tendo-se verificado nascimento de diversos produtos [6, 16-18], confirmando as observações de Dawson et al. (1977) [19], a respeito de que a maioria das fêmeas bovinas classificadas como inférteis mostrava-se capaz de produzir gametas viáveis. Se a aspiração folicular apresentou-se viável para fêmeas com limitações reprodutivas, sua aplicação mostrou-se mais ampla quando utilizada em fêmeas saudáveis, produzindo quatro vezes mais embriões em relação à TE [20], embora com maior custo por embrião [21].
Objetivando aumentar a eficiência e reduzir o investimento inicial para realização da técnica, a OPU tem sido estudada por diversos grupos [22]. A maior produção de embriões pelo procedimento in vitro em relação à TE, tem feito com que muitos criadores também optem pela PIV, buscando mais rapidez na produção de descendentes de vacas de linhagens superiores. A biotecnologia referente a PIV encontra-se difundida por vários países, mas o Brasil alcançou uma posição de destaque frente ao número surpreendente de embriões produzidos por esta técnica. Isto se deve a uma particularidade conferida às vacas zebuínas, que em geral apresentam maior número de folículos recrutados por onda, em comparação com vacas de raças européias [23-24]. Em especial, destacamos a valorização da raça Nelore nos últimos anos como responsável pelo crescimento bastante rápido da PIV no Brasil. Além dessa variação do tipo racial ? gado europeu ou zebuíno ? há as variações individuais, e outros fatores de ordem biológica e técnica diretamente relacionados à eficiência do procedimento de aspiração folicular in vivo.
Os aspectos técnicos compreendem tipo e freqüência do transdutor, a agulha de punção, pressão de vácuo, enquanto os de ordem biológica abrangem as variações individuais, fase reprodutiva, terapias gonadotróficas e tamanho dos folículos, aspectos a serem abordados adiante. O conhecimento das variáveis técnicas contribui para o evidente crescimento da aspiração folicular, no entanto é essencial que este procedimento seja realizado com muito critério, de forma a evitar danos à doadora. Considerando o fato dos ovários serem as estruturas responsáveis pelo armazenamento e viabilidade de todos os gametas femininos [22].

2. Metodologias

Considerado ser a aspiração transvaginal com a ultra-sonografia o método mais eficiente para obtenção de oócitos in vivo, as considerações serão referentes à esta técnica. Através do exame ultra-sonográfico as fêmeas com baixo potencial para o fornecimento de oócitos podem ser identificadas momentos antes da OPU. Como estratégia para a melhoria da relação custo benefício nos programas de PIV, as doadoras podem ser classificadas como aptas quando o exame ultra-sonográfico dos ovários apresentar uma população satisfatória de folículos com diâmetro maior que 3 mm [25]. A freqüência do transdutor constitui-se em variável importante no processo de recuperação dos oócitos [26]. Há citações de freqüências de 3.5 MHz [8], 7.5 MHz [27, 47], 5.0 MHz [1,16,41] e 6.5 MHz [28,45].
O transdutor endo-vaginal humano, ou micro-convexo, mostrou-se altamente adequado às condições anatômicas de vacas pequenas e novilhas pré-púberes [29], além de permitir ótima visualização dos folículos em vacas de grande porte, por facilitar a manipulação ovariana, apresentar uma imagem com alta resolução e possuir imagem com grande ângulo de abertura [30]. A maioria dos autores cita a utilização de transdutores convexos ou setoriais para a aspiração folicular transvaginal [14,6,13,31-32], com poucos relatos de transdutores lineares [26,33]. O transdutor setorial demonstrou ser mais eficiente para a visualização de pequenos folículos, quando comparado ao transdutor linear [1]. No entanto, o transdutor linear é bastante difundido na área de reprodução em grandes animais [34-38] e a sua utilização para a aspiração folicular transvaginal foi demonstrada com sucesso [39]. O principal aspecto desfavorável da aspiração com o transdutor linear refere-se ao espaço limitado entre o transdutor e a agulha. A restrição de espaço impede que todas as regiões do ovário sejam puncionadas, mesmo modificando-se o posicionamento da gônada. É evidente que os transdutores do tipo convexo propiciam um procedimento mais rápido e facilitado [30]. No entanto, a versatilidade do transdutor linear deve sempre ser considerada quando a utilização do ultra-som não for exclusiva para OPU. Neste caso, é possível a obtenção de resultados satisfatórios sem a necessidade de aquisição de outro transdutor.
Inicialmente, a aspiração era realizada apenas com agulhas longas (55 cm), produzidas especificamente para aspiração folicular [9]. Posteriormente, propôs-se a substituição por agulhas hipodérmicas descartáveis, pois as agulhas descritas inicialmente apresentavam custo elevado e perdiam o gume rapidamente, prejudicando a recuperação dos oócitos [12]. Em relação às agulhas longas, devido ao preço, é comum observar-se que uma mesma agulha seja utilizada para vários animais. Com a perda do gume, o bisel apresenta menor capacidade de penetrar o ovário, obrigando o operador a utilizar mais força durante a punção. Nesta situação, há dois aspectos desfavoráveis. O primeiro e mais grave é a possibilidade de danos ao estroma ovariano, especialmente naqueles animais submetidos repetidas vezes à técnica. O segundo aspecto refere-se à pior recuperação de oócitos. À medida que a agulha vai se tornando romba, aumentam as possibilidades de ocorrer uma ruptura abrupta do folículo almejado, ao invés de uma perfuração rápida e precisa. Esta ruptura abrupta poderia dificultar a captação do oócito do interior do folículo, reduzindo a eficiência da técnica. Considerando estes aspectos críticos da agulha longa, Bols et al. (1997)[40] demonstraram a viabilidade da utilização de agulhas hipodérmicas descartáveis de 18 e 19 Gauge (G) e 50 mm de comprimento [1]. As agulhas com diâmetros maiores de 18 G relacionaram-se a maiores taxas de recuperação embora com maior percentual de oócitos desnudos, além de maiores danos ao estroma e maior quantidade de sangue no líquido aspirado. Já as agulhas de diâmetro menor que 19 G apresentam índices reduzidos de recuperação de oócitos, possivelmente pela lentidão da aspiração do líquido folicular, no momento da punção. Uma vez verificada a possibilidade de utilização de agulhas hipodérmicas, buscou-se avaliar a relação entre o comprimento do bisel da agulha e a taxa de recuperação de oócitos [40]. Estes autores acreditavam que o bisel curto seria mais eficiente, pela maior facilidade de ser introduzido rapidamente no interior do folículo. Contrariando as expectativas, os autores relataram melhor recuperação e qualidade de oócitos quando agulhas de bisel longo foram utilizadas [41]. A provável justificativa seria o gume mais afiado do bisel longo, permitindo uma penetração rápida e precisa no interior do folículo, dificultando o extravasamento do conteúdo folicular. A melhor eficiência das agulhas de bisel longo constituiu aspecto bastante favorável, já que estas são mais baratas e facilmente adquiridas, quando em comparação com as de bisel curto. Em relação ao comprimento, as agulhas hipodérmicas de 50 mm possuem restrita distribuição no mercado, mas são perfeitamente substituíveis pelas de 40 mm. Portanto, em relação às agulhas hipodérmicas descartáveis, as opções mais viáveis no mercado nacional seriam as agulhas 40mmx9 e 40mmx10. Considerando seu preço irrisório, torna-se perfeitamente possível utilizar uma agulha por vaca, ou mesmo uma por ovário, naqueles animais que apresentarem maior número de folículos para aspiração. Desta forma, o procedimento de recuperação dos oócitos pode ser realizado com mínimos danos ao estroma ovariano [22].
Estreitamente relacionado com a agulha utilizada encontra-se a pressão de vácuo [42]. Estes autores relacionaram que baixas pressões, como 50 mm Hg, foram pouco eficientes para a aspiração, enquanto que pressões maiores como 120 mm Hg danificavam o revestimento do cumulus oophorus. Há uma grande variação entre os trabalhos, com valores de 40 a 400 mm Hg [14], embora isto deva ser considerado com reservas, já que todo o sistema (comprimento e diâmetro de conexões, altura do equipamento de vácuo, diâmetro da agulha) pode influenciar na pressão de vácuo final. Para quantificar a pressão negativa de forma mais real, sugere-se mensurar o vácuo em volume de fluido por minuto. Mesmo assim, há variações consideráveis, de 4,4 a 40 ml de água/minuto [9,43-45]. O intervalo entre 10 a 20 ml de fluido por minuto tem sido o mais utilizado atualmente, sendo pertinente que a aferição seja readequada a cada procedimento. As bombas de vácuo descritas inicialmente ? Handle Cook ? foram especialmente designadas para a obtenção de oócitos em vacas [9]. Tais equipamentos possuem grande estabilidade na pressão de vácuo, permitindo considerável eficiência na recuperação dos oócitos. Um aspecto desfavorável é seu custo elevado, fator que motivou a busca de bombas de vácuo alternativas. Verifica-se atualmente a utilização alternativa de bombas de aspiração odontológicas, de fluidos endotraqueais, além de bombas de infusão controlada. Todos estes equipamentos prestam-se à geração de vácuo, embora as variações na capacidade de gerar pressão negativa possam comprometer a quantidade e qualidade dos oócitos.

3. Eficiência

A eficiência do procedimento de aspiração folicular transvaginal está diretamente relacionada a metodologia adequada. Sendo que as variáveis técnicas para a obtenção de oócitos possuem considerável impacto sobre a quantidade e a morfologia dos complexos cumulus oophorus (CCOs), e conseqüentemente sobre a competência para o desenvolvimento [40]. Outro aspecto relevante está relacionado as variações individuais entre doadoras, considerando-se peso, idade e a própria variação fisiológica de cada animal. Relatos de oócitos de qualidade inferior em animais senis são freqüentes. Looney et al. (1994) [6] relataram a possibilidade de aspiração folicular nos animais bastante jovens, e Brogliatti & Adams (1996) [46] obtiveram oócitos de bezerras com apenas 6 semanas de idade com a utilização de um transdutor adequado. A origem dos oócitos apresenta um significativo impacto para o seu potencial desenvolvimento. Os animais pré-púberes têm mostrado reduzida competência de seus oócitos para chegar até blastocisto [48-49], embora Armstrong et al. (1994) [5], tenham conseguido resultados animadores com bezerras de apenas três semanas de idade através do estímulo gonadotrófico. Os animais senis produzem poucos oócitos e com baixo percentual de desenvolvimento, além da baixa qualidade devido ao pequeno número de camadas de células do cumulus [50]. Parece haver um consenso quanto à condição corporal, em que animais subnutridos seriam doadores de oócitos com menor capacidade para desenvolverem-se até blastocisto [51], e há indícios de que animais submetidos à situações de estresse também seriam doadores de oócitos menos competentes [52].
Em relação à variação individual, o aspecto mais interessante refere-se à raça. Animais da raça Nelore, ou vacas zebuínas em geral apresentam normalmente um maior número de folículos recrutados por onda, em comparação com vacas de raças européias [23-24]. Esta particularidade viabilizou um crescimento bastante rápido da PIV no Brasil, uma vez que a disseminação da PIV e a maior valorização da raça Nelore ocorreram de forma simultânea. Embora a TE continue sendo largamente utilizada em animais da raça Nelore, a PIV viabiliza maior número de embriões em um mesmo período de tempo [53]. A raça Nelore tem sido promissora ao ponto de se considerar que a aspiração folicular semanal pode produzir um bezerro por semana, através da PIV [54]. Apesar do semelhante potencial entre os indivíduos da mesma raça, a variabilidade individual entre doadoras na produção de uma população viável de folículos pode influenciar os resultados da OPU. Leivas et al. (2003) [55] observaram que houve uma significativa variação na média do número de CCO entre as doadoras Bos indicus, submetidas ao mesmo número de sessões de OPU. Parâmetros reprodutivos como o recrutamento e desenvolvimento folicular podem variar amplamente entre pares de gêmeas monozigóticas [56].
Apesar do enfoque para a espécie bovina, a comparação entre vacas (Bos indicus) e búfalas (Bubalus bubalis), tornou-se relevante devido a disseminação da técnica de PIV. As estruturas ovarianas nas búfalas foram cerca de 50% inferiores as observadas nas vacas zebuínas [57]. Estes resultados podem refletir a maior dificuldade, na espécie bubalina, para obtenção de embriões in vitro [58], comparativamente ao bovino zebuíno, em virtude do menor número de folículos e oócitos com cumulus compacto obtido por ovário [57].
Atualmente, a aspiração folicular tem sido realizada em momentos aleatórios do ciclo estral. Os resultados de campo têm mostrado que a qualidade dos oócitos não se altera com função da fase do ciclo estral. No entanto, o número de folículos disponíveis para a aspiração apresenta considerável variação, sendo o início de onda o momento mais favorável para a recuperação, pelo maior número de folículos e pela melhor eficiência de captação dos oócitos, de acordo com Seneda et al. (2001) [59]. Hendriksen et al. (2004) [27] atribuíram ao folículo dominante o fato de reduzir o desenvolvimento e a competência dos oócitos pertencentes aos folículos subordinados. Portanto, a OPU realizada nos dias 2-5 do ciclo estral ou 2-5 dias após a divergência do folículo dominante poderia incrementar a PIV [27].
A competência do oócito obtido pela aspiração folicular transvaginal parece não ser influenciada pelo tamanho do folículo, mas o mesmo não ocorre em relação à taxa de recuperação, que demonstrou ser significativamente superior para folículos menores ou iguais a 4 mm [60]. A taxa de recuperação consiste no número de oócitos recuperados após punção de 100 folículos [9] e já foi demonstrado que folículos menores viabilizam recuperação oocitária mais eficiente [59]. A taxa de recuperação pode ser influenciada pelas terapias gonadotróficas [13,61]. Roover et al. (2005) [28] consideraram que a aplicação exógena de FSH foi capaz de aumentar o tamanho dos folículos, mas não houve alteração quantitativa, atribuindo a este último aspecto, como uma variação individual. Pieterse et al. (1992) [61] realizaram a aspiração folicular três dias após estímulo gonadotrófico com PMSG e relataram aumento do número e tamanho de folículos, e pior taxa de recuperação de oócitos. Pieterse et al. (1991) [11] e Goodhand et al. (1999) [62] relataram melhor recuperação quando predominavam folículos pequenos no ovário e menos oócitos por sessão quando havia predomínio de folículos maiores que 6 mm. Resultados análogos foram descritos por Seneda et al. (2001) [59], ao compararem folículos < 4 mm e > 4 mm.
A relação inversa entre maior diâmetro folicular e taxa de recuperação de oócitos por sessão tem sido justificada de diversas formas, como alterações morfológicas no complexo cumulus oophorus [31], viscosidade do fluido folicular [62] e quantidade de material a ser aspirado e pressão intrafolicular [63]. Apesar dos folículos maiores que 5 mm serem aspirados mais facilmente [64], a aspiração de folículos pequenos mostrou-se mais eficiente quanto à captação dos oócitos [59]. Assim, a estratégia mais eficiente para associar utilização de FSH e presença de folículos pequenos é controlar o período de crescimento folicular, conforme relatado por Seneda et al.(2002) [24]. Os resultados de Ueno et al. (2004) [65] sugeriram que a aplicação exógena de LH aumentou o número e a qualidade dos oócitos recuperados nos folículos com 5-8 mm de diâmetro, quando comparados aos animais que foram tratados apenas com FSH.
Apesar de relatos em animais zebuínos [67], é importante ressaltar que a utilização de gonadotrofinas tem acontecido principalmente em vacas de raças européias. Os animais Bos indicus apresentam naturalmente maior número de folículos por onda, e talvez por este motivo o FSH tenha tido um impacto menor no crescimento folicular e conseqüente disponibilidade de oócitos para a produção de embriões [68].
Merton et al. (2003) [69] consideraram que a utilização de FSH anterior à aspiração folicular durante 2 semanas otimizou a produção de embriões por sessão. No entanto, a freqüência de OPU afetou a qualidade e a quantidade dos oócitos coletados. A OPU quando realizada de forma descontínua (entre o início do estro e 12 dias após), permitiu que as doadoras retornassem a ciclicidade de forma natural, não afetando a função ovariana. Entretanto, a OPU contínua pode alterar o período de ovulação. Os estudos de Petyim et al. (2003) [70] demonstraram que o número de oócitos não diferiu em ambos os esquemas de aspiração, mas sugeriram que a OPU descontínua seja aplicada.
A aspiração folicular in vivo é eficiente ao ponto de produzir embriões in vitro à partir de doadoras com infertilidade adquirida. Vacas Nelore clinicamente saudáveis e que não responderam a TE e a inseminação artificial (IA), produziram embriões in vitro viáveis e prenhezes à partir dos oócitos recuperados pela OPU [71]. Entretanto, no caso das salpingites graves associadas a aderência ovariana, a qualidade dos ovócitos foi comprometida e, conseqüentemente, a PIV. As patologias de tuba uterina que não apresentam aderências permitiram a obtenção de embriões in vitro, ainda que com baixos índices [72].
Mesmo diante de inúmeras vantagens, a OPU pode ter sua eficiência alterada pelas variáveis biológicas e técnicas, como abordado anteriormente. Devemos também considerar a habilidade do operador, como um importante fator capaz de influenciar os resultados da OPU. Portanto, a seleção de doadoras, a metodologia adequada e a habilidade do operador formam o conjunto de fatores que podem interferir na obtenção de oócitos.

4. Seqüelas

Com o advento da técnica de PIV, tornou-se possível um elevado aproveitamento genético de animais selecionados. De forma rápida e eficiente, esta biotecnologia mostrou ser capaz de proporcionar um grande número de descendentes. A avaliação periódica dos animais submetidos a punções foliculares pode favorecer o monitoramento da ocorrência e intensidade de lesões subseqüentes ao procedimento.
Os resultados de Viana et al. (2002) [73] demonstraram que as perfurações do fundo de saco vaginal foram prontamente cicatrizadas, e em apenas duas ocasiões foram observadas irritações transitórias da vagina e cérvix. Em geral não se observou processos clínicos inflamatórios ou infecciosos na vagina ou no restante da porção tubular do trato genital [74]. Já os pontos de perfuração do fundo de saco vaginal puderam ser identificados até 48 a 72 horas após as punções [74]. A formação de hematomas na região perivaginal também pode ser encontrada [29] mas esta condição não parece acarretar grandes problemas para a doadora. Ao contrário do observado na região vaginal, Viana et al. (2003) [74] constataram a incidência de significativas alterações na consistência ou mobilidade dos ovários. As perfurações dos ovários podem ocasionar o aparecimento de seqüelas como aderência e fibrose, particularmente em vacas submetidas a muitas sessões de punção. É importante considerar o grande impacto das variáveis técnicas e a habilidade do operador na ocorrência destas lesões.
Alterações histológicas como a mineralização do parênquima ou no interior de estruturas foliculares, foram encontradas independente do número de sessões de punção folicular em que as vacas foram submetidas [75]. Pontos de perfuração na túnica albugínea, presença de áreas com hemorragias e infiltrados de células inflamatórias, fibrose no estroma ovariano, associado a cicatrizes no trajeto da agulha, constituíram as alterações histopatológicas ovarianas demonstradas por Viana et al. (2003) [74].
Em fêmeas submetidas a biópsia guiada por ultra-sonografia transvaginal, o exame histológico demonstrou intenso infiltrado de células vermelhas no estroma variano [76]. Analisando animais puncionados, Demarque et al (2003) [75] observaram através da histologia a presença de corpo lúteo e de folículos normais, indicando atividade cíclica ovariana regular.
Viana et al. (2003) [74] observaram que folículos previamente aspirados apresentaram hemorragia interna e graus variados de desorganização das camadas da parede folicular. Observou-se também, a presença de áreas de tecido luteal ou de células luteais dispersas no estroma ovariano, provavelmente originadas da luteinização parcial de folículos cuja parede foi fragmentada pela punção. A luteinização de folículos puncionados, em particular, seria responsável pelas concentrações subluteais de progesterona observadas em animais puncionados intensamente [77].
Nos ovários submetidos a maior número de punções, o espessamento do epitélio ovariano, comprometeu a visualização externa dos folículos em crescimento, quando os ovários foram avaliados macroscopicamente [74]. Animais submetidos a até 20 sessões de punção, apresentaram baixa incidência de lesões, coerente com a observação de que o procedimento não causa, necessariamente, comprometimento da atividade ovariana [66].
Viana et al. (2002) [73] não observaram redução na recuperação de oócitos por vaca no decorrer do seu período experimental, mesmo quando foram constatadas seqüelas ao tratamento.
É importante considerar que a aspiração folicular é uma técnica que possui prós e contras. O risco de seqüelas existe e deve ser considerado. A realização do procedimento deve ser feita de maneira a reduzir ao máximo os danos possíveis, para que os resultados obtidos superem os inconvenientes previstos.

5. Perspectivas

A obtenção de oócitos através da aspiração folicular in vivo é apenas a primeira etapa para a produção in vitro de embriões. Depois que os oócitos são recuperados, os processos de maturação, fecundação e desenvolvimento são realizados em laboratórios específicos.
Os principais desafios para maior disseminação da aspiração folicular são o alto custo dos equipamentos e a dedicação necessária ao treinamento da técnica. Maior padronização na recuperação dos oócitos será obtida com a aplicação de protocolos de sincronização do estro, visando a realização da aspiração em momentos mais propícios.
Finalizando, é importante salientar que a OPU/FIV não é boa, nem má. Como toda biotécnica, trata-se de uma ferramenta a serviço da pecuária. Se usada adequadamente, propicia resultados satisfatórios, correspondendo às expectativas do investimento. No entanto, se mal utilizada, pode causar danos às doadoras, ou, o que é pior, gerar grande número de animais geneticamente inferiores.
Portanto, ressaltamos a necessidade da análise cuidadosa de cada proposta de trabalho com OPU/FIV, tanto por parte dos criadores como dos veterinários, para que a melhor parcela desta biotécnica possa contribuir para o engrandecimento da pecuária nacional.

6. Referências Bibliográficas

[1] BOLS, P.E.J., LEROY, J.L.M.R., VANHOLDER, T., VAN SOOM, A. A comparison of a mechanical sector and a linear array transducer for ultrasound-guided transvaginal oocyte retrieval (OPU) in the cow. Theriogenology, v. 62, p. 906-914, 2004.
[2] REICHENBACH H.D. Embryo transfer and cryopreservation in cattle: practical considerations. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 28-50, 2003.
[3] LAMBERT, R. D., SIRARD, M.A., BERNARD, C., BÉLAND, R., RIOUX, J.E., LECLERC, P., MÉNARD, D.P.,BEDOYA, M. In vitro fertilization of bovine oocytes matured in vivo and collected at laparoscopy. Theriogenology, v. 25, n. 01, p. 117-133, 1986.
[4] LAURINCÍK, J., PÍCHA, J., PÍCHOÁ, D., OBERFRANC, M. Timing of laparoscopies aspiration of preovulatory oocytes in heifers. Theriogenology, v. 35, n. 02, p. 415-423, 1991.
[5] ARMSTRONG, D. T., IRVINE, B.J., EARL, C.R., McLEAN, D., SEAMARK, R.F. Gonadotropins stimulations regimens for follicular aspiration and in vitro embryo productions from calf oocytes. Theriogenology, v. 42, p. 1227-1236, 1994.
[6] LOONEY, C. R., LINDSEY, B.R., GONSETH, C.L., JOHNSON, D.L. Commercial aspects of oocyte retrieval and in vitro fertilization (IVF) for embryo production in problem cows. Theriogenology, v. 41, p. 67-72, 1994.
[7] HINRICHS, K., KENNEY, D.F., KENNEY, R.M. Aspiration of oocytes from mature and immature preovulatory follicles in the mare. Theriogenology, v. 34, p. 107-112, 1990.
[8] CALLESEN, H., GREVE, T., CHRISTENSEN, F. Ultrasonically guided aspiration of bovine follicular oocytes. Theriogenology, v. 27, p. 217, 1987. (Abstract).
[9] PIETERSE, M. C., KAPPEN K. A., KRUIP, Th.A.M., TAVERNE, M.A.M. Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology, v. 30, n. 04, p. 751-762, 1988.
[10] KRUIP, T. A., PIETERSE, M.C., VAN BENEDEN, T.H., VOS, P.L.A.M., YURTH, Y.A., TAVERNE, M.A.M. A new method for bovine embryo production: a potential alternative to superovulation. Vet. Rec., v. 128, p. 208-210, 1991.
[11] PIETERSE, M. C., VOS, P.L.A.M., KRUIP, T.A.M., WURTH, Y.A., VAN BENEDEN, T.H., WILLEMSE, A.H., TAVERNE, M.A.M. Transvaginal ultrasound guided follicular aspiration of bovine oocytes. Theriogenology, v. 35, n. 01, p. 19-24, 1991.
[12] BOLS, P. E. J., VANDENHEEDE, J.M.M., VAN SOOM, A., KRUIF, A. Transvaginal ovum pick-up (OPU) in the cow: new disposable needle guindance system. Theriogenology, v. 43, p. 677-687, 1995.
[13] MEINTJES, M., BELLOW, M.S., BROUSSARD, J.R., PAUL, J.B., GODKE, R.A. Transvaginal aspiration of oocytes from hormone-treated pregnant beef for in vitro fertilization.Journal of Animal Science,v.73, p.967-974, 1995.
[14] BOLS, P. E. J., VAN SOOM, A., YSEBAERT, M.T., VANDENHEEDE, J.M.M., KRUIF, A. Effects of aspiration vacum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogenology, v. 45, p. 1001-1014, 1996.
[15] STUBBINGS, R.B. & WALTON, J.S. Effect of ultrasonically-guided follicle aspiration on estrous cycle and follicular dynamics in Holstein cows. Theriogenology, v. 43, p. 705-712, 1995.
[16] HASLER, J. F., HENDERSON, W.B., HURTGEN, P.J., JIN, Z.Q., McCAULEY, A.D., MOWER, S.A., NEELY, B., SHUEY, L.S., STOKES, J.E., TRIMMER, S.A. Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, v.43, p. 141-152, 1995.
[17] BOLS, P. E. J., VAN SOOM, A., YSEBAERT, M.T., VANDENHEEDE, J.M.M., KRUIF, A. Effects of aspiration vacum and needle diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogenology, v. 45, p. 1001-1014, 1996b.
[18] SENEDA, M.M., ESPER, C.R., GARCIA, J.M., VANTINI, R. Effect of follicle size on recovery, quality, and developmental competence of oocytes obtaine in vitro. Abstracts of 14th International Congress on Animal Reproduction, Stockholm, Sweden v.01, p.62, 2000a (Abstract).
[19] DAWSON, F.L.M. Reproductive potential in female cattle discarded as infertile. J. Reprod. Fert., v. 51. 53-56, 1977.
[20] KRUIP, T.A.M., BONI, R., WURTH, Y.A., ROELOFSEN, M.W.M., PIETERSE, M.C. Potential use of ovum pick-up for embryo production and breeding in cattle. Theriogenology, v. 42, p. 675-684, 1994.
[21] RODRIGUES, C.F.M., GARCIA, J.M. Fecundação in vitro: aplicação comercial. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v.28, n.1,p. 186-187, 2000.
[22] SENEDA, M.M. & BLASCHI, W. Ovum pick up em bovinos: considerações técnicas. 1º Simpósio Internacional de Reprodução Animal Aplicada. p. 231-237, 2004.
[23] DAYAN, A.; WATANABE, M. R.; WATANABE, Y. F. Fatores que interferem na produção comercial de embriões FIV. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS. V. 28, n. 1, p. 181-185, 2000.
[24] SENEDA, M.M.; ESPER; C.R., ANDRADE; E.R., GARCIA; J.M., OLIVEIRA; J.A. Shorter interval between fsh adminIstration and follicle aspiration increases efficiency of oocyte recovery, Theriogenology, v. 57, p. 684, 2002. (Abstract).
[25] COSAC FARIA, L., ACHILLES, M., FERNÁNDEZ, M.B., LEMOS, D.C., LÔBO, R.B. Pre-selection of donors for follicular puncture: impact on productivity. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 301, 2003. (Abstract).
[26] HASHIMOTO, S., TAKAKURA, R., KISHI, M., SUDO, T., MINAMI, N., YAMADA, M. Ultrasound-guided follicle aspiration: effect of the frequency of a linear transvaginal probe on the collection of bovine oocytes. Theriogenology, v. 52, p. 131-138, 1999.
[27] HENDRIKSEN, P.J.M., STEENWEG, W.N.M., HARKEMA, J.C., MERTON, J.S., BEVERS, M.M., VOS, P.L.A.M., DIELEMAN, S.J. Effect of different stages of the follicular wave on in vitro developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology, v. 61, p. 909-902, 2004.
[28] ROOVER, de R., GENICOT, G., LEONARD, S., BOLS, P., DESSY, F. Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. . Animal Reproduction Science, v. 86, p. 13-25, 2005.
[29] SAUVÉ, R. Ultrasound guided follicular aspiration and in vitro fertilization. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS. V. 26, n. 1, p. 141-155, 1998.
[30] AERTS, J.M.J., LEROY, J.L.M.R., BOLS, P.E.J. The use of an endovaginal ultrasound micro-convex array transducer adapted for tranvaginal oocyte retrieval in the cow. Abstracts of 15th International Congress on Animal Reproduction, Porto Seguro, Brasil v.02, p.435, 2004. (Abstract).
[31] BOLS, P.E.J., YSEBAERT, M.T., LEIN, A., CORYN, M., VAN SOOM, A., KRUIF, A., Effects of long-term treatment with bovine somatotropin on follicular dynamics and subsequent oocyte and blastocyst yield in an OPU-IVF program. Theriogenology, v. 49, p. 983-995, 1998.
[32] CARLIN, S.K., GARST, A.S., TARRAF, C.G., BAILEY, T.L., McGILLIARD, M.L., GIBBONS, J.R., AHMADZADEH, A., GWAZDAUSKAS, F.C. Effects of ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration on oocyte recovery and hormonal profiles before and after GnRH treatment. Theriogenology, v. 51, p. 1489-1503, 1999.
[33] MATTHEWS, L.; PETERSEN, H.; VAN BEEK, K. Use of linear ultrasound transducer for commercial application of transvaginal oocyte recovery. Theriogenology, v. 43, p. 275, 1995. (Abstract).
[34] SIANANGAMA, P.C. & RAJAMAHENDRAN R. Effect of hCG administration on day 7 of the estrous cycle on follicular dynamics and cycle length in cows. Theriogenology v.45, n.3, p. 583-592, 1996.
[35] BARUSELLI, P.S. , MUCCIOLO, R.G. , VISINTIN, J.A. , VIANA, W.G. , ARRUDA, R.P. , MADUREIRA, E.H., OLIVEIRA, C.A., MORELO-FILHO, J.R. Ovarian follicular dynamics during the estrous cycle in buffalo (Bubalus bubalis). Theriogenology v.47, n.8, p. 1531-1547, 1997.
[36] FIGUEIREDO, R.A. BARROS, C.M., PINHEIRO, O. L. SOLER, J.M.P. Ovarian follicular dynamics in Nelore breed (Bos indicus) cattle. Theriogenology v.47, n.8, p.1489-1505, 1997.
[37] LEYVA, V. BUCKRELL, B.C.; WALTON, J.S. Regulation of follicular activity and ovulation in ewes by exogenous progestagen. Theriogenology v.50, n.3, p. 395-416, 1998.
[38] DICKIE, M. C. PATERSON, ANDERSON, J. L. M.; BOYD, J. S. Determination of corpora lutea numbers in Booroola - Texel ewes using transrectal ultrasound. Theriogenology v.51, p. 1209-1224, 1999.
[39] SENEDA, M. M.; ESPER, C. R.; GARCIA, J. M.; ANDRADE, E. R.; BINELLI, M.; OLIVEIRA, J. A.; NASCIMENTO, A. B. Efficacy of linear and convex transducers for ultrasound-guided transvaginal follicle aspiration. Theriogenology v.59, p. 1435-1440, 2003.
[40] BOLS, P. E. J., YSEBAERT, M.T., VAN SOOM, A., KRUIF, A. Effects of needle tip bevel and aspiration procedure on the morphology and developmental capacity bovine compact cumulus oocyte complexes. Theriogenology, v. 47, p. 1221-1236, 1997.
[41] MANIK, R.S., SINGLA, S.K., PALTA, P. Collection of oocytes through transvaginal ultrasound-guided aspiration of follicles in an Indian breed of cattle. Animal Reproduction Science, v. 76, p. 155-161, 2003.
[42] BOLS, P.E.J., VAN SOON, A., VANROOSE, G., KRUIF, A. Transvaginal oocyte pick-up in infertile Belgium Blue donor cows: preliminary results. Theriogenology, v. 45, p. 359, 1996a. (Abstract)
[43] VOS, P.L.A.M., de LOS, F.A.M., PIETERSE, M.C., BEVERS, M.M., TAVERNE, M.A.M., DIELEMAN, S.J., Evaluation of transvaginal ultrasound-guided follicle puncture to collect and follicular fluids at consecutive times relative to the preovulatory LH surge in eCG/PG treated cows. Theriogenology, v. 41, p. 829-840, 1994.
[44] RICK, G., HADELER, K.G., LEMME, E., LUCAS-HAHN, A., RATH, D., SCHINDLER, L., NIEMANN, H. Long-term ultrasound guided ovum pick-up in heifers from 6 to 15 months of age. Theriogenology, v. 45, p. 356, 1996. (Abstract).
[45] BUNGARTZ, L., LUCAS-HAHN, A., RATH, D., NIEMANN, H. Collection of oocytes from cattle via follicular aspiration aided by ultrasound with or without gonadotropin pretreatment and in different reproductive stages. Theriogenology, v. 43, p. 667-675, 1995.
[46] BROGLIATTI, G. M., ADAMS, G. P. Ultrasound-guided transvaginal oocyte collection in prepurbetal calves. Theriogenology, v.45, p. 1163-1176, 1996.
[47] VAN DER SCHANS, A. VAN DER WESTERLAKEN, L.A.J., DE WIT, A.A.C., EYESTONE, W.M., DE BOER, H.A. Ultrasound-guided transvaginal collection of oocytes in the cow. Theriogenology, n. 35, p. 288, 1991. (Abstract).
[48] REVEL, F.L., MERMILLOD, P., PEYNOT, N., RENARD, J.P., HEYMAN, Y. Low developmental capacity of in vitro matures and fertilized oocytes from calves compared with that of cows. Journal of Reproduction and Fertility., v.103, p. 115-120, 1995.
[49] RIZOS, D., BURKE, L., DUFFY, P., WADE, M., MEE, J.F., O?FARREL, K.J., McSIURTAIN, M., BOLAND, M.P., LONERGAN, P. Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitro. Theriogenology, v. 63, p. 939-949, 2005.
[50] GARCIA, J.M, ESPER, C.R., AVELINO, K.B., PUELKER, R.Z., VANTINI, R., ALMEIDA Jr., I., RODRIGUES, C.F.M. Desempenho e limitações na produção in vitro de embriões bovino de vacas com infertilidade adquirida. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v.27, n.1,p. 237, 1999. (Abstract).
[51] LOPEZ RUIZ, L., ALVAREZ, N., NUNEZ, I., MONTES, I., SOLANO, R., FUENTES, D., PEDROSO, R., PALMA, G.A., BREM, G. Effect of body condition on the developmental competence of IVM/IVF bovine oocytes. Theriogenology, v. 45, p. 292, 1996. (Abstract).
[52] SENEDA, M.M., ESPER C.R., GARCIA, J.M. VANTINI, R. Effect of follicle size on recovery, quality, and developmental competence of oocytes obtained in vitro. Abstracts of 14th International Congress on Animal Reproduction, Stockholm, Sweden v.01, p.62, 2000a (Abstract).
[53] NONATO JUNIOR, I.; RUFINO, F.A., SANCHES, B.V., PONTES, J. H. F.; UVO, S.; ERENO JUNIOR, J. C.; SENEDA, M.M. Produção de embriões em vacas Nelore com a utilização associada de FIV e TE. Acta Scientiae Veterinariae, v. 32, p. 95, 2004. (Abstract).
[54] WATANABE, M.R., LÔBO, R.B., FRANCESCHINI, P.H., DAYAN, A., VILA, R.A., GALERANI, M.A.V., WATANABE, Y.F. Embryo in vitro production per session of follicular aspiration in Nelore cows. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS. V. 26, n. 1, p. 383, 1998. (Abstract).
[55] LEIVAS, F.G., BRUM, D.S., RUFINO, F.A., GUIMARÃES, A.V., BERNARD, M.L., SILVA, C.ªM., RUBIN, M.I.B. Response of the Bos indicus cow to aspiration per OPU session and in vitro produced blastocyst. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 411, 2003. (Abstract).
[56] MACHADO, S.A., REICHENBACH, H.D., WEPERT, M., MATOS, L.F., WOLF, E., GONÇALVES, P.B.D. Variability in ovump pick up and in vitro embryo production results of monozygotic twin cows. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 443, 2003. (Abstract).
[57] OHASHI, O.M., COSTA, S.H.F., MACHADO, A.C.M., DANTAS, J.K. Ovarian characteristics of zebu cattle (Bos indicus) and buffaloes (Bubalus bubalis) cow. Arq. da Faculdade de Veterinária UFRGS. V. 26, n. 1, p. 333, 1998.
[58] GASPARRINI,B. In vitro embryo production in buffalo species: state of the art. Theriogenology, v. 57, p. 237-256, 2002.
[59] SENEDA, M.M.; ESPER, C.R., GARCIA, J.M., VANTINI, R.; OLIVEIRA, J.A. Relationship between follicle size and ultrasound-guided transvaginal oocyte recovery. Animal Reproduction Science, v. 67, p. 37-43, 2001.
[60] SENEDA, M.M., ESPER, C.R., GARCIA, J.M, VANTINI, R. Relação entre tamanho do folículo e aspiração folicular transvaginal para o desenvolvimento in vitro de embriões. Arq. Fac. de Vet UFRGS, v.27, n.1,p. 293, 1999.
[61] PIETERSE, M.C., VOS, P.L.A.M., KRUIP, T.A.M., WURTH, Y.A., VAN BENEDEN, T.H., WILLEMSE, A.H., TAVERNE, M.A.M. Repeated transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up in ECG-treated cows. Theriogenology, v. 37, p. 273, 1992. (Abstract).
[62] GOODHAND, K.L., WATT, R.G., STAINES, M.E., HUTCHINSON, J.S.M., BROADBENT, P.J. In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from bovine donors aspirated at different frequencies or following fsh treatment. Theriogenology, v. 51, p. 951-961, 1999.
[63] SENEDA, M.M. Aspiração folicular transvaginal guiada pela ultra-sonografia. Efeito do diâmetro do folículo sobre a recuperação, qualidade e competência do oócito para o desenvolvimento in vitro.1999. Dissertação (Mestrado em Patologia Animal). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 57 p., UNESP, Jaboticabal, 1999.
[64] BOLS, P.E.J. Transvaginal ovum pick-up in the cow: technical and biological modifications. 1997. 227p. Thesis (PhD). Faculty of Veterinary Medicine, University of Ghent, Belgium, 1997(a).
[65] UENO, V.G., FONTES, R.S., FONSECA, F.A., GAMA FILHO, R.V., RAMOS, J.L.G., BUCHER, C.H., LOPES, F.S., CARVALHO, C.S.P., MARTINS, R.P. Effect of the hormonal treatment on recovery rate and oocytes competence of the Guzerá breed obtained through ?OPU? preliminary results. Abstracts of 15th International Congress on Animal Reproduction, Porto Seguro, Brasil v.02, p.436, 2004. (Abstract).
[66] GIBBONS, J.R., BEAL, W.F., KRISHER, R.J., FABER, F.G, PEARSON, R.F., GWAZDAUSKAS, F.C. Effect of once versus twice-weekly transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and embryo development. Theriogenology, v. 42, p. 405-419, 1994.
[67] NONATO JUNIOR, I.; PONTES, J. H. F.; ERENO JUNIOR, J. C.; BLASCHI, W.; UVO, S.; OLIVEIRA, J. A.; SENEDA, M.M. FSH prior follicle aspiration: comparison beteween two gonadotropins to in vitro embryo production. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 513, 2003. (Abstract).
[68] BLASCHI, W., ANDRADE, E.R., NONATO JUNIOR, I.; PONTES, J. H. F.; ERENO JUNIOR, J. C.; UVO, S.; SENEDA, M.M. Utilização prévia do Pluset na aspiração follicular: impacto na produção in vitro de embriões em vacas Bos indicus . Acta Scientiae Veterinariae, v. 32, p. 186, 2004. (Abstract).
[69] MERTON, J.S., ROOS, A.P.W., MULLAART, E., RUIGH, L., KAAL, L., VOS, P.L.A.M, DIELEMAN, S.J. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology, v. 59, p. 651-674, 2003.
[70] PETYIM, S., BAGE, R., HALLAP, T., BERGQVIST, A.S., RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H., LARSSON, B. Two different schemes of twice-weekly ovum pick up in dairy heifers: effect on oocyte recovery and ovarian function. Theriogenology, v. 60, p. 175-188, 2003.
[71] OHASHI, O.M., SOUSA, J.S., MIRANDA, M.S., BIONDI, F.C., CORDEIRO, M.S. In vitro embryo production in Nelore cows with acquired in fertility. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 515, 2003. (Abstract).
[72] PEIXER, M.A.S., CÂMARA, J.U., NASCIMENTO, N.V., PAIVA, M.A.N., RUMPF,R. Animal production by ovum pick up (OPU) in cows with different fertility levels. Arq. da Fac. de Vet UFRGS. V. 26, n. 1, p. 345, 1998.
[73] VIANA, J.H.M., CAMARGO, L.S.A, FERREIRA, A.M., SÁ, W.F., FERNANDES, C.A.C., ARAÚJO, M.C.C., RAMOS, A.A., MARQUES Jr, A.P. Ovarian pre-stimulation with FSH, active immunization against inhibin and follicular aspiration results in Gir cattle (Bos indicus). Theriogenology, v. 57, p. 630, 2002.
[74] VIANA, J.H.M., NASCIMENTO, A.A., PINHEIRO, N.L., FERREIRA, A.M., CAMARGO, L.S.A, SÁ, W.F., MARQUES Jr, A.P. Caracterização de sequëlas subseqüentes à punção folicular em bovinos. Pesquisa Vet. Bras. V. 23, n.3, p. 119-124, 2003.
[75] DEMARQUE, K.C., RODRIGUES, C.F.M., NOGUEIRA, L.A.G., PINHO, T.G., TORTELLY, R. Histologic changes in ovaries of cows submitted to repeated follicular punctures. Acta Scientiae Veterinariae, v. 31, p. 315, 2003.
[76] AERTS, J.M.J, OSTE, M., BOLS, P.E.J. Development and practical applications of a method for repeated transvaginal, ultrasound-guided biopsy collection of the bovine ovary. Theriogenology, v. xx, p. xx, 2005.
[77] VIANA, J.H.M., FERREIRA, A.M., CAMARGO, L.S.A, SÁ, W.F., ARAÚJO, M.C.C., FERNANDES, C.A.C., MARQUES Jr, A.P. Efeito da administração de progestágenos exógenos sobre a produção de oócitos em vacas submetidas à punção folicular. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v.28, n.1,p. 342, 2000.



Rua Henrique Savi, 5-86 - CEP 17012-205 - Vila Universitária, Bauru - SP
Fone: (14) 3214-4272 / 3214-4272 / (14)9.9123-5440 What - financeiro@bioembryo.com.br - 2017 ® Bioembryo
Desenvolvido por ZR Midia Soluções Interativas