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O bloqueio meiótico e a maturação in vitro
Por: Cláudia Lima Verde Leal e Paulo Roberto Adona

A demanda por oócitos bovinos tem sido crescente para produção de embriões por fecundação in vitro (FIV), clonagem ou transgênese. A FIV vem sendo cada vez mais utilizada comercialmente, inclusive no Brasil. A produção de blastocistos, porém, tem se mantido em 30-40%. In vivo, o oócito termina sua fase de crescimento bloqueado em prófase da meiose I contido em um folículo de 2-3 mm, que continua crescendo até atingir um diâmetro ³ 15mm. Após a onda pré-ovulatória de LH, o oócito retoma a meiose até metáfase II (maturação) quando é ovulado. Entre o final do crescimento do oócito e o início da maturação (capacitação ou pré-maturação), ocorrem modificações ultra-estruturais e moleculares relacionadas com a competência para o desenvolvimento após a fecundação. ver comentarios

Na maturação in vitro (MIV) são normalmente selecionados oócitos de folículos de 3-6mm. O oócito removido do folículo retoma espontaneamente a meiose sem ter passado pela capacitação, o que poderia estar relacionado com a menor competência do oócito. Um cultivo pré-maturação, mantendo-se o oócito em bloqueio meiótico in vitro, permitiria ao mesmo um período adicional para passar pela capacitação e melhorar sua competência. Inibidores de quinases dependentes de ciclinas, como a butirolactona I, têm sido utilizados para este fim. Embora esse procedimento ainda não tenha resultado, de forma geral, num aumento das taxas de desenvolvimento embrionário, tem se prestado como ferramenta importante para obter informações acerca do gameta feminino. Estas informações são de grande valia para melhorar os sistemas de MIV, e conseqüentemente, a produção in vitro (PIV) de embriões.

Palavras-chave: meiose, butirolactona I, inibidores de CDK, MPF, capacitação, pré-maturação


Introdução
A demanda por oócitos bovinos para produção de embriões por fecundação in vitro (FIV), ou ainda, para utilização em clonagem por transferência de núcleos (TN) ou transgênese (TG) tem sido cada vez mais intensa. Embora estas técnicas tenham ainda uma maior aplicação para pesquisa, elas já vêm tendo alguma aplicação comercial nos países desenvolvidos, no caso da TN e TG, e no caso da FIV, já vem sendo mais amplamente utilizada comercialmente, inclusive no Brasil (Dayan et al., 2000; Rodrigues e Garcia, 2000). No entanto, apesar dos muitos estudos e grandes avanços nessas áreas, a obtenção de oócitos competentes para o desenvolvimento embrionário tem se mantido nos últimos anos relativamente estável na faixa dos 30-40% de blastocistos após a FIV (Hyttel et al., 2001; Lonergan et al., 2001; Rizos et al., 2002).
Estas técnicas envolvem uma série de etapas, mas certamente a maturação in vitro, é uma das etapas cruciais. O desenvolvimento de embriões obtidos por métodos de manipulação in vitro depende largamente da qualidade e competência dos oócitos para a maturação, fecundação e subseqüente desenvolvimento.
Já foi demonstrado que oócitos in vivo, ao final de seu período de crescimento, mas antes de seu período de maturação propriamente dito, passam por um período denominado de capacitação ou pré-maturação, importante para o desenvolvimento pleno de sua competência. Neste período ocorrem modificações ultra-estruturais e moleculares no oócito importantes para a retomada da meiose (maturação final) e desenvolvimento pós-fecundação (Hyttel et al., 1997, Dieleman et al., 2002).
Sabe-se que a remoção do oócito do ambiente folicular, prática realizada para obtenção de oócitos para maturação in vitro (MIV), resulta na retomada espontânea da meiose nos mesmos, interrompendo o período de capacitação. Foi sugerido que uma das formas de promover esse período de capacitação oocitária in vitro, seria pela inibição da retomada da meiose por um determinado período de tempo antes da maturação (pré-maturação; Lonergan et al., 1997; Hendriksen et al., 2000).
Inibidores específicos de quinases dependentes de ciclinas (CDKs do inglês cyclin dependent kinases), tais como a butirolactona I e seu análogo sintético a roscovitina, vêm sendo utilizados para estudos sobre o papel do fator promotor da maturação (MPF do inglês maturation promoting factor) na regulação da meiose, durante a maturação de oócitos, uma vez que atuam de forma específica sobre a atividade desta quinase. Além disso, ambos inibidores têm sido utilizados para promover o bloqueio meiótico em bovinos (Kubelka et al., 2000; Ponderato et al., 2001, 2002; Hashimoto et al., 2002), suínos (Marchal et al., 2001; Krischek e Meinecke, 2002; Wu et al., 2002) e eqüinos (Hinrichs et al., 2002).
Embora os inibidores sejam eficientes na promoção de bloqueio reversível (Kubelka et al., 2000; Pavlok et al., 2000), seus efeitos sobre o desenvolvimento embrionário não têm sido prejudiciais, mas também, na maioria dos casos, não apresentam melhorias no desenvolvimento embrionário. As taxas de desenvolvimento de blastocistos têm sido, em geral, semelhantes às dos controles não inibidos (Lonergan et al., 2000; Mermillod et al., 2000; Ponderato et al., 2001). Hashimoto et al. (2002), porém, obtiveram taxas de desenvolvimento a blastocistos superiores aos controles, bem como um incremento significativo do número de células nos embriões obtidos. Ponderato et al. (2002) observaram ainda que o desenvolvimento fetal normal após esse tipo de tratamento é possível. Coy et al. (2005b) obtiveram o nascimento de leitões oriundos de oócitos pré-maturados com roscovitina.
Essas observações sugerem que o bloqueio meiótico não é prejudicial ao potencial de desenvolvimento embrionário e dessa forma possa ser uma ferramenta para o estudo do controle da meiose e também para o desenvolvimento de protocolos mais adequados para a aquisição de competência para o desenvolvimento de oócitos utilizados para a produção in vitro de embriões.

Oogênese, foliculogênese e competência para o desenvolvimento
Nos mamíferos, a oogênese tem início durante o desenvolvimento fetal. Por volta dos 80 dias de gestação (bovinos) inicia-se a meiose (Rüsse, 1983). O ciclo celular, no entanto, é bloqueado na prófase da meiose I, conhecido também como estádio de vesícula germinativa (VG), e assim permanece por meses ou anos até a puberdade. Pouco antes da ovulação, os oócitos são estimulados a retomar a meiose em resposta à onda pré-ovulatória de hormônio luteinzante (LH) e o ciclo celular progride até o estádio de metáfase II (MII), quando bloqueia novamente. Este ciclo só será reiniciado e completado, após a ovulação, quando houver a fecundação pelo espermatozóide que provoca a sua ativação. Uma vez ativado o oócito completa a meiose e inicia os ciclos mitóticos do desenvolvimento embrionário.
O processo que ocorre quando o oócito reinicia a meiose a partir de prófase I e a conclui até a fase de metáfase II é chamado de maturação oocitária. A maturação é caracterizada por três componentes: 1) a maturação nuclear que consiste na modificação da configuração da cromatina, característica da progressão do ciclo celular: prófase I (PI), metáfase I (MI), anáfase I (AI), telófase I (TI), metáfase II (MII) com emissão do 1º corpúsculo polar; 2) a maturação citoplasmática que envolve uma série de modificações na distribuição e organização de organelas e modificações do citoesqueleto e 3) a maturação molecular representada pelo acúmulo de instruções produzidas durante o período de crescimento do oócito e que controlam a maturação nuclear e citoplasmática (Sirard, 2001). A maturação culmina com a aquisição, pelo oócito, da capacidade de ser fecundado e desenvolver-se em um embrião.
A foliculogênese, por usa vez, inicia-se com a formação dos folículos primordiais, quando uma única camada de células pavimentosas (células pré-granulosas) se posiciona em torno do oócito primário por volta dos 90 dias de gestação em bovinos (Szollosi,1991 apud Meyes, 2002). Esta estrutura tem um diâmetro de cerca de 40 mm (van Wezel e Rodgers, 1996), contendo um oócito de cerca de 30 mm (Picton, 2001). Posteriormente, as células tornam-se cubóides (células da granulosa) dando origem ao folículo primário aos 140 dias de gestação. Inicia-se a formação da zona pelúcida e das junções comunicantes entre as células da granulosa e o oócito (Rüsse, 1983). Em torno de 210 dias de gestação, as células foliculares multiplicam por mitose dando origem ao folículo secundário, que apresenta pelo menos duas camadas de células da granulosa e um oócito de 50-60 mm (Hyttel et al., 1997). Na fase seguinte, começa a surgir uma cavidade preenchida com líquido (antro), dando origem ao folículo antral ou terciário aos 230 dias de gestação (Rüsse, 1983). O folículo tem agora cerca de 120-280 mm de diâmetro (Monniaux et al., 1997). Quando o folículo atinge ~3 mm de diâmetro, o oócito chega a cerca de 120 mm, reduzindo muito seu ritmo de crescimento e cessando a sua atividade de síntese de RNA (Hyttel et al., 1997). Daí por diante, o folículo cresce em tamanho até atingir o diâmetro pré-ovulatório (15-20 mm) enquanto o oócito tem um pequeno crescimento (Arlotto et al., 1996). Após o pico de LH, será retomada a meiose do oócito nele contido, que será ovulado em metáfase II (Callesen et al., 1986).
A competência para o desenvolvimento se refere à capacidade do oócito em produzir um novo indivíduo após a fecundação (Hyttel et al., 1997). Ao longo do desenvolvimento folicular há um aumento gradual da competência para o desenvolvimento (Gandolfi e Gandolfi, 2000). Dentre vários fatores, o tamanho do folículo e do oócito parecem ter estreita correlação com a competência oocitária (Hyttel et al., 1997; Hendriksen et al., 2000).
Lonergan et al. (1994), obtiveram 66% de blastocistos a partir de oócitos de folículos maiores (6-8 mm) e 34% a partir de folículos menores (2-6 mm). Yang et al. (1998) demonstraram que oócitos oriundos de folículos pequenos (<2 mm) são incompetentes para o desenvolvimento tanto após a fecundação in vitro (FIV) como após ativação partenogenética e concluíram que a incompetência dos oócitos de folículos pequenos é devido a ambos o núcleo e o citoplasma.
Oócitos de diferentes diâmetros também apresentam competência meiótica e de desenvolvimento distintos. Na medida em que o oócito aumenta de diâmetro, este vai adquirindo progressiva e seqüencialmente a capacidade de retomar a meiose (quebra da VG), progredir até MI, MII e, finalmente, de desenvolver-se em um embrião (Hyttel et al., 1997). Parece haver um limite mínimo de competência em que oócitos estão aptos a desenvolver após a fecundação. Em bovinos esse limite ocorre quando os oócitos atingem um diâmetro mínimo de 110-120 mm e que tenham sido obtidos de folículos de pelo menos 3 mm de diâmetro (Hyttel et al., 1997, 2001). Isso indica, que a competência para retomar e concluir a meiose, e posteriormente para ser fecundado e desenvolver-se em um embrião viável, é adquirida de forma gradual com o crescimento do oócito e do folículo ovariano. Pode-se dizer, porém, que a competência para a maturação citoplasmática pode ser adquirida juntamente, mas não é coincidente com a maturação nuclear. Isso é patente, uma vez que se observa que uma proporção bem menor de oócitos atinge o estádio de blastocisto (30-40%) em relação àquela que atinge a maturação nuclear (>80% de MII).

O bloqueio meiótico in vivo
Está bem estabelecido que o oócito, enquanto mantido dentro do ambiente folicular, permanece bloqueado em VG. O AMPc presente em altos níveis dentro do oócito tem sido apontado como o principal responsável pela manutenção do bloqueio da meiose do oócito até o momento da maturação, visto que sua redução é um sinal necessário para a maturação ovocitária (Conti et al., 1998; Eyers et al., 2005). O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que exerce um importante controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados (Bilodeau-Goeseels, 2003). As células da granulosa seriam responsáveis pela síntese do AMPc que passaria ao oócito pelas junções comunicantes (gap junctions; Edry et al., 2006). Por outro lado, observou-se que o oócito também possui a enzima necessária para a síntese desse nucelotídeo (adenilato ciclase), sendo, portanto, capaz de sua produção (Mehlman et al., 2005). Ainda não foi provado se uma ou ambas as vias são utilizadas para manter o oócito em VG, porém está claro que altos níveis de AMPc são necessários para tal bloqueio e que o mesmo ocorre pela ação do AMPc em manter o MPF inativado (Duckworth et al., 2002).

A retomada da meiose ? maturação
A retomada do ciclo celular meiótico (maturação) está sob o controle, principalmente, do MPF. O MPF é uma proteína quinase composta por duas subunidades, a p34cdc2 e a ciclina B. A p34cdc2 é sintetizada constantemente enquanto a ciclina B é sintetizada e destruída ciclicamente, dando desta forma o controle cíclico característico do ciclo celular. O MPF encontra-se em níveis basais em oócitos em estádio de VG e com o reinício da meiose começa a se elevar atingindo níveis máximos em metáfase I (MI). Depois declina entre MI e MII para se reativado e atingir um novo pico em metáfase II (MII). Neste ponto, mantém-se elevado até que haja a ativação do oócito na fecundação (Motlik et al., 1998).
O que desencadeia a ativação do MPF, que caracteriza bioquimicamente a retomada da meiose e, conseqüentemente, o início da maturação, parece ser a concentração de AMPc no complexo cumulus-oócito. Quando há uma redução dos níveis de AMPc, finda a inibição sobre a atividade do MPF (Goren e Dekel, 1994). Uma vez ativo, o MPF desencadeia os eventos observados na maturação nuclear: quebra da VG (germinal vesicle breakdown - GVBD), condensação dos cromossomos, formação do fuso meiótico e extrusão do 1º corpúsculo polar.
Além do MPF um outro fator importante que participa do controle da meiose do oócito é a proteína quinase ativada por mitógeno (mitogen activated protein kinase - MAPK). De acordo com Gordo et al. (2001), enquanto o MPF estaria relacionado à retomada da meiose, a MAPK estaria relacionada com o segundo bloqueio meiótico em metáfase II, manutenção dos níveis elevados de MPF durante essa fase e organização do fuso meiótico. A MAPK está envolvida na dinâmica dos microtúbulos que são responsáveis pelo deslocamento da cromatina para a periferia e rearranjo das organelas no citoplasma do oócito (Verlhac et al., 1994). A MAPK também é inativa em VG e torna-se ativada com a retomada da meiose (observada pela GVBD) ligeiramente depois do MPF, mas ao contrário deste, a MAPK mantém-se elevada na transição MI-MII (Motlik et al., 1998).

A capacitação ou pré-maturação in vivo
Blondin et al. (1997) estudando o efeito do intervalo entre o abate e a recuperação dos oócitos dos ovários, observaram que melhores resultados poderiam ser obtidos mantendo os oócitos dentro dos folículos ovarianos por até 4 horas após o abate, comparativamente aos puncionados imediatamente após o abate. Concluíram neste estudo, que a aquisição de competência para o desenvolvimento pode ocorrer, em parte, antes mesmo da maturação in vitro. Os estudos do Blondin et al. (2002) in vivo, também reforçam essa observação. Trabalhando com intervalos variáveis entre o tratamento de superovulação de vacas e a aspiração folicular guiada por ultra-som, seguida de maturação, fecundação e o cultivo in vitro, observaram que intervalos maiores levavam a maiores taxas de desenvolvimento, alcançando até cerca de 80% de blastocistos. Rizos et al. (2002a,b), concluíram que a qualidade dos embriões obtidos na PIV seria relacionada ao sistema de cultivo in vitro, mas que as taxas de desenvolvimento (porcentagem de blastocistos) seria relacionada à qualidade intrínseca do oócitos antes mesmo da maturação.
Tais observações correspondem bem às conclusões dos estudos de Assey et al. (1994), onde oócitos de folículos dominantes antes da onda de LH e, portanto, antes da maturação, sofrem modificações nucleares e citoplasmáticas envolvidas com a competência para o desenvolvimento. Hyttel et al. (1997) estudando a ultra-estrutura de oócitos ao longo de sua fase de crescimento in vivo antes de maturação, observaram que durante essa fase, onde o oócito encontra-se dentro de um folículo também em crescimento, ocorre uma série de eventos que incluem: desenvolvimento de organelas e inclusões tais como retículo endoplasmático liso, complexo de Golgi, vesículas, gotículas de lipídios, grânulos corticais; formação da zona pelúcida; modificação morfológica das mitocôndrias; formação das gap junctions com as células da granulosa. Além disso, os oócitos acumulam transcritos e proteínas necessários para a competência para o desenvolvimento que correspondem à intensa atividade do nucléolo.
Quando o oócito atinge o diâmetro de 110 mm, já ao fim da fase de crescimento, o nucléolo vai sendo inativado. No entanto, no período entre o final do crescimento do oócito até a onda pré-ovulatória de LH que estimula a retomada da meiose e início da maturação oocitária, o oócito não entra numa total quiescência. Algumas modificações são observadas e incluem redução dos microvilos e do complexo de Golgi, retração das ligações com as células da granulosa, aumento do espaço perivitelino, aumento da quantidade de gotículas de lipídios, início do deslocamento dos grânulos corticais para a periferia, ondulação da membrana nuclear e modificação da morfologia do nucléolo. Essa modificação nucleolar poderia estar relacionada a uma retomada de sua atividade transcricional. Esse intervalo foi denominado de ?capacitação oocitária? e estaria relacionado com a aquisição final de competência para o desenvolvimento pelo oócito (Hyttel et al., 1997).

Bloqueio meiótico ou pré-maturação in vitro
Nos procedimentos de maturação in vitro (MIV), utilizam-se usualmente folículos entre 3-6 mm de diâmetro, no entanto, é provável que uma parte considerável desta população seja incompetente para o desenvolvimento. Os oócitos ao serem removidos do ambiente folicular, deixam de ter o sinal que mantém o bloqueio meiótico e reiniciam espontaneamente a meiose. Este reinício poderia ser, em muitos casos, precoce, ou seja, o oócito ainda não estaria apto para maturar eficientemente e, portanto, para fecundar e desenvolver (Hyttel et al., 1997; Hendriksen et al. 2000). Possivelmente seria necessário manter os oócitos por mais tempo em VG para que tenham tempo suficiente para adquirir a competência.
Lonergan et al. (1997) e Hendriksen et al. (2000) sugeriram que uma pré-maturação in vitro poderia permitir que oócitos, que tiveram o final de seu desenvolvimento encurtado pela remoção precoce do ambiente folicular, fossem capazes de ?alcançar? os estádios finais de seu desenvolvimento. Mantendo-se os oócitos bloqueados seria possível procurar mimetizar o período da capacitação.
A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas quinases e fosfatases controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Desta forma, a meiose pode ser bloqueada por drogas que mantenham altas concentrações de AMPc no interior do oócito (Bilodeau-Goeseels, 2003), por inibidores não específicos da síntese protéica (Saeki et al., 1997; Meinecke et al., 2001), de proteínas quinases (Andriesz et al., 2000; Dode e Adona, 2001) ou por inibidores específicos do MPF (Kubelka et al., 2000; Hashimoto et al., 2002; Adona e Leal, 2004).
A manipulação dos níveis de AMPc tem tido algum sucesso na pré-maturação de oócitos de camundongos (Nogueira et al., 2003) e humanos (Nogueira et al., 2006). Oócitos bovinos, porém, parecem ser menos sensíveis à manipulação dos níveis de AMPc para controlar a meiose. O bloqueio é possível por períodos mais curtos de tempo e parece retardar a perda de comunicação entre as células da granulosa e o oócito, que ocorre logo após a remoção do oócito do folículo (Thomas et al., 2004). Grupen et al. (2006), porém, obtiverem resultados semelhantes entre a milrinona (inibidor de fosfodiesterase) e butirolactona I (inibidor de CDK) em termos de bloqueio, reversibilidade e desenvolvimento embrionário após tratar oócitos suínos na primeira metade do período de maturação.
Inibidores de síntese protéica como a cicloheximida e de fosforilação protéica como a 6-DMAP (Saeki et al., 1997; Lonergan et al., 1997; Lonergan et al. 1998; Avery et al., 1998; Dode e Adona, 2001) também foram utilizados para manter os oócitos em bloqueio meiótico pré-maturação. No entanto, embora obtivessem bloqueio reversível e desenvolvimento de blastocistos, o desenvolvimento foi inferior aos controles. Estas substâncias são de amplo espectro e poderiam estar interferindo com outras vias bioquímicas/metabólicas importantes. Como a retomada da meiose é caracterizada pela ativação do MPF, um inibidor específico de MPF permitiria a manutenção dos oócitos em bloqueio meiótico.
Algumas drogas inibem especificamente a fosforilação do MPF, mantendo-o inativo e, conseqüentemente, permitindo um bloqueio meiótico sem interferência com outras proteínas do oócito. A butirolactona I (BLI) é uma purina derivada de micélios de Aspergillus sp e inibe especificamente quinases dependentes de ciclinas (Motlik et al., 1998). Além desta, existem seus análogos sintéticos como a roscovitina (ROS) e a bohemine (BOH).
A ROS (Mermillod et al., 2000), a BLI (Kubelka et al., 2000; Lonergan et al., 2000; Motlik et al., 2000), a associação das duas (Ponderato et al., 2001) e a BOH (Adona e Leal, 2004) já foram utilizadas com algum sucesso para bloquear a meiose em oócito de vacas adultas e mesmo de bezerras (Donnay et al., 2004; Alabarracín et al. 2005). Essas drogas também já foram utilizadas em outras espécies como suínos (Wu et al., 2002; Ju et al., 2003; Le Beaux et al., 2003; Romar e Funahashi, 2006), eqüinos (Hinrichs et al., 2002) e caprinos (Jimenez-Macedo et al., 2006; Han et al., 2006).
A meiose é inibida de forma eficiente e reversível por períodos variados de tempo, de 24 h (Mermillod et al., 2000; Kubelka et al., 2000; Lonergan et al., 2000), 48 h (Kubelka et al., 2000) e até 70 h (Pavlok et al. 2000). No entanto, as taxas de desenvolvimento a blastocisto nesses trabalhos não chegaram a ser melhores que as obtidas sem o uso de inibidores, mantendo-se em 30-40% (Mermillod et al., 2000; Lonergan et al., 2000; Ponderato et al., 2001). Hashimoto et al. (2002), por outro lado, conseguiram um aumento significativo nas taxas de desenvolvimento e número de células dos blastocistos em relação aos controles, incluindo soro fetal bovino no meio de inibição com 100 mM de BLI e reduzindo a tensão de O2 durante o cultivo de pré-maturação.
O impacto do bloqueio meiótico na ultraestrutura dos oócitos após 8 h (Faerge et al., 2001) ou 40 h de bloqueio (Fair et al., 2002) revelou que no primeiro caso o período de cultivo foi insuficiente para induzir as alterações esperadas e no segundo caso foi excessivo, causando danos consideráveis em diversas estruturas e organelas dos oócitos tratados. Avery et al. (2002), por sua vez, observaram que oócitos oriundos de folículos de diferentes tamanhos tratados com ROS por 24 horas assemelhavam-se, em termos de distribuição de mitocôndrias, com oócitos obtidos por punção folicular in vivo de folículos de maior diâmetro.
Embora haja indícios de que um bloqueio meiótico pré-maturação poderia ser benéfico para o desenvolvimento embrionário posterior, ainda não foram desenvolvidos sistemas que permitam um bloqueio meiótico mais eficiente de forma a mimetizar in vitro o ambiente inibitório presente in vivo no folículo até momentos antes da ovulação, de modo que o oócito seja capaz de sofrer a capacitação. Boa parte dos trabalhos limitou-se a avaliar a eficiência do bloqueio, sua reversibilidade e seu feito sobre o desenvolvimento embrionário, tendo havido poucos estudos sobre outros parâmetros ou modificação nas condições do cultivo pré-maturação. A manipulação das condições de cultivo e do momento da fecundação poderia melhorar os resultados da inibição meiótica sobre o desenvolvimento embrionário.
Alguns estudos foram realizados visando determinar melhores condições para a indução do bloqueio meiótico e verificar a ocorrência de modificações estruturais e moleculares nos oócitos. Inicialmente diferentes inibidores de quinases dependentes de ciclinas foram comparados e observou-se que a BLI induz um bloqueio meiótico mais eficaz e reversível sem reduzir o desenvolvimento embrionário (Adona e Leal, 2004). A ROS e a BOH, embora tenham bloqueado a meiose de forma reversível, levaram a uma redução do desenvolvimento embrionário.
Alguns trabalhos utilizando tais inibidores mostraram que a cinética da maturação após o bloqueio é acelerada (Ponderato et al., 2001; Lagutina et al., 2002; Hashimoto et al., 2002; Wu et al., 2002), o que interferiria no momento ideal para realização da FIV. Averiguando-se o efeito do tempo de exposição e da concentração da BLI sobre a cinética da maturação nuclear in vitro, observou-se que quanto maior o tempo de exposição à droga, mais rápida é a cinética da maturação, com antecipação da retomada da meiose durante a MIV em cerca de 3 horas. Mesmo uma exposição por tempo mais curto (6h), já foi capaz de acelerar a maturação nucelar. Além disso, verificou-se também que para períodos de bloqueio mais curtos (6-12h) uma concentração mais baixa de BLI (50mM) pode ser usada, mas para manter o bloqueio por 24h é necessário utilizar uma concentração maior de BLI (100mM) (Adona e Leal, 2006).
Na tentativa de minimizar o efeito da BLI na cinética da maturação buscou-se reduzir a concentração de BLI. Ponderato et al. (2001) utilizaram uma mistura de inibidores a baixas concentrações (12,5mM BLI e 6,25mM de ROS), mas também observaram a aceleração da meiose. Ao utilizar uma concentração ainda mais baixa (10mM BLI), Adona (2006) observou que a cinética ainda assim manteve-se acelerada, sendo esse padrão um efeito do bloqueio da meiose utilizando essas drogas e não um efeito apenas de concentração.
Essa aceleração, no entanto, não reduz o desenvolvimento embrionário posterior. Diversos estudos mostraram desenvolvimento similar aos controles apenas maturados in vitro (Adona e Leal, 2004; Adona e Leal, 2006), podendo em alguns casos melhorar as taxas de blastocisto (Hashimoto et al., 2002; Coy et al., 2005a). Além disso, esse tipo de tratamento não prejudica fases posteriores do desenvolvimento. Já foram obtidas gestações de embriões bovinos produzidos por FIV (Ponderato et al., 2001) e por clonagem (Adona et al, 2006, dados não publicados) e desenvolvimento a termo em suínos (Coy et al., 2005b) e bovinos (Adona et al., 2003, dados não publicados).
O significado e as causas dessa aceleração não estão esclarecidos, mas sugere-se que durante o bloqueio ocorreria o acúmulo de fatores necessários à progressão meiótica e que ao remover-se o inibidor a meiose se daria de forma mais rápida. Durante o bloqueio, a síntese protéica (Marchal et al., 2001), a fosforilação protéica (Vigneron et al. 2004a) e a transcrição (Lequarre et al., 2004) não são bloqueadas. Wu et al. (2002) notaram que a MAPK é rapidamente ativada após o bloqueio. O MPF também parece ser reativado mais rapidamente durante a maturação in vitro, quando os oócitos são bloqueados por 24h tanto com alta (100mM) ou baixa (10mM) de BLI antes da MIV (Leal et al., 2006, dados não publicados).
O bloqueio da meiose deve ser induzido de forma reversível e também não deve produzir danos estruturais ao oócito. O efeito do uso da BLI sobre o citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) e alguns aspectos da maturação citoplasmática como a migração de mitocôndrias e grânulos corticais (GC) também foram analisados. O bloqueio da meiose não provocou alterações observáveis ao citoesqueleto (Adona, 2006), observação importante, pois a reorganização da distribuição das organelas e dos cromossomos durante a maturação é dependente do citoesqueleto e importante para a maturação do oócito (Connors et al., 1998; Kim et al., 2000; Sun et al., 2001abc). A migração dos GC foi bloqueada, indicando que tal migração é de alguma forma também controlada pelo MPF. As mitocôndrias por outro lado, migraram em parte dos oócitos, indicando que o MPF pode não ser o responsável ou único responsável pelo controle da migração de mitocôndrias nos oócitos. Após a remoção da BLI, a migração das organelas durante a maturação ocorreu de forma similar aos oócitos apenas maturados in vitro, indicando que ao menos esses parâmetros não são negativamente afetados pelo bloqueio meiótico induzido in vitro com BLI.
De forma geral, os trabalhos indicam que o bloqueio da meiose per se, não é capaz de mimetizar todas as condições a que se submete um oócito dentro do um folículo antes da maturação. A maioria dos estudos utiliza condições de cultivo com meios relativamente pobres, sendo TCM-199 sem aditivos (Ponderato et al., 2001; Lagutina et al., 2002; Adona, 2006) ou acrescidos apenas de BSA (Kubelka et al., 2000; Imai et al., 2003; Adona e Leal, 2004), SFB (Hashimoto et al, 2002; Ponderato et al., 2002; Coy et al., 2005a), hormônios (Beker van Woundenberg et al., 2006). Mais estudos são necessários para determinar melhores condições de cultivo durante o bloqueio (pré-maturação) e a maturação, que poderão resultar em protocolos mais eficazes para a PIV.
De toda forma, o bloqueio da meiose pode ser usado como ferramenta de pesquisa como modelo para compreensão dos mecanismos envolvidos no envelhecimento do oócito (Tatone et al., 2006), em estudos sobre o controle da identificação de marcadores de competência (Sanfins et al., 2004), o efeito de diferentes fatores durante o período de bloqueio da meiose como hormônios (Sirard e Coenen, 1994; Beker van Woundenberg et al., 2006) ou fontes energéticas (Bilodeau-Goeseels, 2006), controle dos vários processos envolvidos na maturação do oócito como condensação de cromossomos (Kubelka et al., 2002; Jeliková e Kubelka, 2006), expansão das células do cumulus (Vigneron et al., 2003), vias de sinalização (Vigneron et al., 2004b), tradução, transcrição (Vigneron et al., 2004a) e poliadenilação de RNAm (Lequarre et al., 2004). Além disso, o bloqueio pode ser utilizado para flexibilização de horários de maturação mais convenientes para procedimentos de FIV ou clonagem (Imai et al., 2002; Lagutina et al., 2002), transporte de oócitos aspirados em locais distantes dos laboratórios de PIV (Hashimoto et al., 2003). Mais conhecimentos acerca do oócito e do ambiente folicular a que é exposto in vivo, aliado aos dados obtidos de estudo in vitro, permitirão o desenvolvimento de condições mais eficientes para a produção de embriões in vitro.

Conclusões
Apesar dos grandes avanços na produção in vitro, a obtenção de embriões se mantém em média nos 30-40%. Parte do problema reside na qualidade intrínseca do oócito utilizado nos procedimentos de maturação, fecundação e cultivo in vitro. A competência para o desenvolvimento do oócito parece se influenciada, ao menos em parte, pelo período que permanece no folículo antes da maturação, onde sofre uma série de modificações chamadas de capacitação ou pré-maturação. Ao remover os oócitos do ambiente folicular para cultivo in vitro, a meiose é logo retomada e a fase de capacitação é interrompida. A utilização de drogas que interferem no controle da meiose do oócito, permite mantê-lo bloqueado in vitro para que tenha tempo adicional para passar pelo processo de capacitação. Tal processo, porém, bem como o próprio controle da meiose, não estão completamente elucidados.
Embora a indução do bloqueio meiótico in vitro não seja capaz de melhorar o desenvolvimento embrionário, pode ser uma ferramenta importante para estudar diferentes aspectos da biologia do oócito, envolvendo o controle da meiose e sua preparação para tornar-se um gameta competente para o desenvolvimento. À medida que se tenham mais dados acerca do que ocorre com o oócito dentro do folículo dominante e do controle do ciclo celular meiótico do gameta feminino, melhores condições haverá para o desenvolvimento de protocolos mais eficientes de PIV.

Agradecimentos
À Faperj e Fapesp pela concessão de auxílios à pesquisa. À Capes, CNPq, Faperj e Fapesp pela concessão de bolsas. À UENF e FZEA-USP pelo apoio institucional. Aos estudantes de graduação e pós-graduação, técnicos e colaboradores dos trabalhos realizados.

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Cláudia Lima Verde Leal e Paulo Roberto Adona (ZAB ? FZEA ? USP, Pirassununga-SP)


(* Obs.: Artigo reproduzido com prévia autorização da autora)



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