Bioembryo - Biotecnologia da reprodução animal

Cadastre-se e receba nossas novidades!

Artigos

Aspectos Técnicos da Produção In Vitro de Embriões Bovinos: Importância da Maturação In Vitro
Por: Profª Drª Gisele Zoccal Mingoti

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos compreende três etapas desenvolvidas no laboratório: a maturação in vitro (MIV), a fecundação in vitro (FIV) e o cultivo de desenvolvimento embrionário in vitro (CIV) até os estádios de mórula ou blastocisto, quando poderão ser transferidos ou criopreservados. ver comentarios

Clique para ampliar

A PIV tem sido alvo de muitas pesquisas e estudos com o intuito de melhorar a sua utilização comercial, já que um dos principais problemas atuais da técnica é a variabilidade nos resultados do desenvolvimento in vitro dos embriões, uma vez que, em média, apenas dentre 30% a 50% dos oócitos maturados se desenvolvem até o estádio de blastocisto. Para a obtenção de melhores resultados com a técnica, muitos estudos têm sido realizados visando avaliar individualmente cada uma das três etapas, procurando ajustar da melhor maneira possível, todas as variáveis envolvidas no processo. Muitos fatores biológicos agem de forma conjunta para preparar o oócito imaturo para um desenvolvimento bem sucedido e um embrião competente depois da fecundação. Defeitos na maturação oocitária podem ser causados por uma inadequada maturação nuclear ou citoplasmática, ou mesmo por uma falha em ambas. A compreensão exata das necessidades metabólicas do oócito em sistemas de cultivo de maturação in vitro é fundamental para que seja estabelecida a condição ideal para que o maior número possível de oócitos maturados in vitro adquiram a competência de desenvolvimento e torne-se hábil para sustentar o desenvolvimento inicial do embrião.

Maturação In Vitro: Aspectos Fisiológicos

Durante a maturação, os oócitos sofrem várias alterações nucleares e citoplasmáticas. Os eventos nucleares incluem: quebra da vesícula germinativa (GBVD), desaparecimento do nucléolo, condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do segundo fuso meiótico. Nesta fase o oócito atinge a metáfase II e então considera-se que a maturação nuclear está completa.
Além da maturação nuclear, vários outros processos atuam no oócito de forma a capacitá-lo a expressar seu potencial de desenvolvimento após a fertilização. A aquisição da competência do oócito envolve uma série de alterações bioquímicas e estruturais, denominadas em seu conjunto de maturação citoplasmática. Alguns eventos citoplasmáticos incluem: redistribuição das organelas intracelulares e maturação dos mecanismos de liberação do cálcio. Nestes processos, o papel dos grânulos corticais é fundamental no bloqueio da polispermia, já que o exsudato destes grânulos secretórios é capaz de alterar a função e promover o endurecimento da zona pelúcida. Já os eventos moleculares relacionados à maturação citoplasmática não são ainda totalmente conhecidos, mas sabe-se que transcritos e proteínas são estocados em uma forma estável durante este período e têm uma importante função durante o desenvolvimento embrionário precoce, quando o genoma embrionário permanece quiescente.
Somente após a conclusão dos processos de maturação nuclear e citoplasmática é que o oócito torna-se equipado com toda a maquinaria celular necessária para permitir o sucesso da fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial, pois a maturação inadequada, seja do núcleo ou do citoplasma, inviabiliza a fecundação e aumenta as ocorrências de polispermia, de partenogênese e de bloqueio do desenvolvimento embrionário.
Estudos recentes tem avaliado o efeito de diversas variáveis no cultivo in vitro de oócitos bovinos sobre a aquisição da competência e qualidade oocitária, como por exemplo a macromolécula adicionada ao meio de maturação (CAIADO CASTRO et al., 2003), suplementos do meio de maturação (MINGOTI et al., 2000), atmosfera gasosa (CAIADO CASTRO et al., 2003), utilização de inibidores da maturação nuclear (SÁ BARRETTO et al., 2003a; SÁ BARRETTO et al., 2003b), efeitos de co-cultivo (ANCIOTO et al., 2004a), dentre outros. Nestes estudos, sempre foi observado que a inadequada maturação do oócito fatalmente acarreta na diminuição das taxas de fecundação e do subsequente desenvolvimento embrionário (CAIADO CASTRO et al., 2003; SÁ BARRETTO et al., 2003a; ANCIOTO et al., 2004b). Estes resultados demonstram que defeitos na maturação oocitária podem possivelmente ser causados por uma inadequada maturação nuclear ou citoplasmática, ou mesmo por uma falha em ambas.
Dentre vários fatores que influenciam a maturação do oócito, alguns são discutidos a seguir.

Fatores que Influenciam o Processo de Maturação In Vitro

Meio de maturação
O meio mais utilizado na MIV de oócitos bovinos é o Tissue Culture Medium (TCM-199). Este meio é modificado de acordo com a rotina de cada laboratório, sendo geralmente adicionado de tampões, aminoácidos, vitaminas, nutrientes, além de hormônios (LH, FSH e estradiol) e soro sanguíneo.

Soro bovino e outras fontes de proteína ou macromolécula
A suplementação do meio de cultura com fontes protéicas de origem animal tem apresentado os melhores resultados na maturação oocitária e no desenvolvimento in vitro de embriões, sendo o Soro Fetal Bovino (SFB) e a Albumina Sérica Bovina (BSA) as fontes protéicas mais usadas. O SFB, quando adicionado ao meio de cultura, proporciona um efeito benéfico à maturação nuclear (MINGOTI et al., 1995), pois contém componentes como fatores de crescimento, aminoácidos e proteínas. Com relação ao BSA, suas funções conhecidas no meio de cultura são: sua capacidade de quelar metais pesados, equilibrar o pH e sua propriedade surfactante que previne adesão de células a superfíces plásticas e de vidro, ação esta possível de ser corrigida com polímeros sintéticos.

Efeitos das gonadotrofinas hipofisárias e hormônios esteróides
As gonadotrofinas exercem um efeito fundamental no processo de maturação do oócito. Os mecanismos pelos quais o LH influencia a maturação de oócitos bovinos incluem a alteração da distribuição de cálcio no ooplasma e a elevação do metabolismo de glutamina no oócito. O FSH induz a maturação do oócito incluso no cumulus, mas não de oócitos desnudos, indicando que o FSH estimula a produção de uma substância sinalizadora pelas células somáticas, que induz a retomada da meiose. O FSH ainda estimula a expansão das células do cumulus dos complexos-cumulus-oócito (COCs), o que consequentemente facilita o processo de fertilização.
Algumas ações celulares do estradiol incluem a promoção do crescimento folicular, aumento da expressão de receptores para FSH e LH nas células da granulosa, controle da formação de junções entre as células da granulosa e inibição de apoptose e morte celular em células da granulosa. Outra função atribuída ao estradiol é promover alterações na reatividade da liberação de cálcio durante a maturação citoplasmática do oócito.

Papel das células foliculares
O oócito e a população de células da granulosa e do cumulus encontram-se interconectados por uma rede extensiva de canais transmembrana conhecidos como gap junctions. As funções fisiológicas das gap junctions no folículo são diversas, fornecendo suporte nutricional, transmitindo sinais elétricos e transportando moléculas mensageiras das células foliculares ao oócito. Estas moléculas mensageiras podem passar através das gap junctions para as células vizinhas, propagando sinais induzidos por estimulação hormonal. Desta maneira, a presença de células foliculares no oócito é imprescindível para obtenção de bons resultados na PIV; a utilização de oócitos desnudos na PIV poderá comprometer todos estes processos, pois estes frequentemente não terão competência para se desenvolver em um embrião viável depois da fecundação. A presença das células do cumulus é benéfica para obtenção de embriões bovinos após FIV, pois a eliminação destas células anteriormente ao processo de maturação diminui a taxa de maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto (ANCIOTO et al., 2004ª; ANCIOTO et al., 2004b). Mesmo na fecundação parecem ser importantes, pois atuam na atração e seleção de espermatozóides, facilitam a capacitação espermática, reação acrossomal e penetração e previnem o endurecimento precoce da zona pelúcida. Provavelmente a secreção de produtos metabólicos do cumulus ao redor do oócito cria um microambiente complexo que é benéfico ao processo de fecundação.

Efeito do tempo de cultivo de maturação
O período de tempo de cultivo de maturação mais utilizado é de 24 horas, muito embora vários trabalhos tenham demonstrado que a FIV de oócitos bovinos maturados por 18 horas resulta em taxas de clivagem e desenvolvimento embrionários semelhantes aos observados em oócitos maturados por 24 horas. Por outro lado, o efeito do envelhecimento do oócito é muito prejudicial, já que oócitos maturados por 32 horas demonstram redução considerável de desenvolvimento embrionário após FIV.

Atmosfera gasosa
A alta concentração de O2 induz a geração de radicais livres, levando a danos intracelulares. Assim, tanto a baixa concentração de O2 como a adição de antioxidantes ao meio de cultura são efetivas na manutenção do desenvolvimento in vitro. Devido a isto, vários estudos tem sido conduzidos com o objetivo de se avaliar o efeito da atmosfera gasosa sobre os processos de PIV. Muito embora as menores concentrações de O2 tenham demonstrado ser benéficas para o desenvolvimento embrionário, o mesmo não foi demonstrado no cultivo de maturação: em atmosfera abaixo de 20% de O2, os oócitos apresentam redução na taxa de maturação, aumento do número de meioses precoces, redução na formação do primeiro corpúsculo polar e decréscimo na taxa de clivagem e de formação de blastocisto (CAIADO CASTRO et al., 2003). Assim, as particularidades de cada uma das etapas de todo o processo de PIV devem ser muito bem compreendidas para que se possa obter resultados satisfatórios.

Conclusões e Perspectivas Futuras

Muito embora já tenha havido muito progresso no desenvolvimento dos protocolos de PIV, ainda será necessário o desenvolvimento de novas pesquisas até que seja estabelecida a condição ideal para que o maior número possível de oócitos maturados in vitro possam ser fecundados e sustentem o subsequente desenvolvimento do embrião. Juntamente com a proteômica, metodologias modernas da genômica, análises seriadas de expressão gênica em combinação com a PCR, PCR em tempo real, técnicas de differential display dentre outras, serão utilizadas de modo crescente nos próximos anos e deverão contribuir enormemente na descoberta de genes específicos que ainda não foram caracterizados em oócitos e células somáticas, e que são essenciais para a fertilidade e para a produção de oócitos viáveis capazes de manter a embriogênese em programas de reprodução assistida.

Gisele Mingoti é Professora de Fisiologia na Unesp, Faculdade de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba, SP, Brasil, CEP 16050-680 - gmingoti@fmva.unesp.br



Citações Bibliográficas

ANCIOTO, K.L.; VANTINI, R.; GARCIA, J.M.; MINGOTI, G.Z. Influência das células do cumulus e do meio de maturação in vitro de oócitos bovinos sobre a maturação nuclear e aquisição da competência do desenvolvimento embrionário. Acta Scientiae Veterinariae, v.32 (Supl.), p.118, 2004a.

ANCIOTO, K.L.; VANTINI, R.; RONCOLETA, M.; MINGOTI, G.Z. Análise de proteínas por eletroforese bi-dimensional de oócitos bovinos maturados in vitro na presença ou ausência de células do cumulus. Acta Scientiae Veterinariae, v.32 (Supl.), p.114, 2004b.

CAIADO CASTRO V.S.D., SÁ BARRETTO L.S., GARCIA J.M., MINGOTI G.Z. Influência do suplemento de macromoléculas e da atmosfera gasosa na maturação de oócitos bovinos. Acta Scientiae Veterinariae, v.31 (Supl.), p.272-273, 2003.

MINGOTI, G.Z. Maturação oocitária associada à esteroidogênese. Papel do soro sanguíneo, albumina sérica e hormônios esteróides. 2000. 141p. Tese (Doutorado em Fisiologia) ? Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2000.

MINGOTI, G.Z., GARCIA, J.M., ROSA-E-SILVA, A.A.M.. Steroidogenesis in cumulus cells of bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with BSA and different concentrations of steroids. Ani. Reprod. Sci. v.69, p.175-186, 2002.

SÁ BARRETTO L.S., CAIADO CASTRO V.S.D., GARCIA J.M., MINGOTI G.Z. Desenvolvimento embrionário a partir de oócitos bovinos maturados in vitro com IBMX e roscovitina. Acta Scientiae Veterinariae, v.31 (Supl.), p.240-241, 2003a.

SÁ BARRETTO L.S., CAIADO CASTRO V.S.D., GARCIA J.M., MINGOTI G.Z. Efeito de inibidores da maturação nuclear sobre a maturação citoplasmática de oócitos bovinos. Acta Scientiae Veterinariae, v.31 (Supl.), p.242-243, 2003b.



Rua Henrique Savi, 5-86 - CEP 17012-205 - Vila Universitária, Bauru - SP
Fone: (14) 3214-4272 / 3214-4272 / (14)9.9123-5440 What - financeiro@bioembryo.com.br - 2017 ® Bioembryo
Desenvolvido por ZR Midia Soluções Interativas