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Aplicação de ferramentas de biologia molecular em embriões bovinos
Por: Simone Cristina Méo Niciura

Como definição, temos que a biologia molecular é o ramo da ciência que estuda a biologia ao nível das moléculas, ou seja, lida com a formação, com a estrutura e com a função dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) e das proteínas, macromoléculas essenciais para a vida.
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Os ácidos nucléicos compõem o material genético, e as proteínas constituem seus produtos de expressão. Assim, a biologia molecular avalia, principalmente, as funções dessas moléculas na replicação celular, na transmissão da informação genética e nos diversos processos celulares.

O conhecimento da biologia molecular permite a manipulação do DNA, por meio de técnicas de DNA recombinante, e leva ao isolamento, à identificação e à modificação seletiva de genes específicos. As técnicas de biologia molecular mais comumente utilizadas são a reação em cadeia da polimerase (PCR) para o DNA e a transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR) para o RNA. Entretanto, em algumas situações várias outras técnicas podem ser associadas à PCR e à RT-PCR. Dentre as técnicas de biologia molecular utilizadas em embriões, destacam-se:

- Reação em cadeia de polimerase (PCR, do inglês polimerase chain reaction): constitui um método de amplificação (obtenção de múltiplas cópias) de uma seqüência-alvo de DNA. A PCR busca mimetizar os eventos que ocorrem durante a replicação do DNA nas células e, por isso, requer um DNA-alvo, a enzima Taq DNA polimerase, os deoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs) com quantidades iguais de dATP, dTTP, dCTP e dGTP e um par de oligonucleotídeos iniciadores específicos (primers). A PCR é realizada num equipamento denominado termociclador e ocorre em três fases, repetidas por diversas vezes (30 a 40 ciclos): desnaturação (> 90ºC), anelamento dos primers (55-65ºC, variável de acordo com o primer e com a seqüência do DNA-alvo a ser amplificado) e extensão pela Taq DNA polimerase (72-75ºC). Como a amplificação é exponencial, a cada ciclo de PCR a quantidade inicial de DNA dobra.

- Transcrição reversa seguida por PCR (RT-PCR, do inglês reverse transcription-polimerase chain reaction): detecta e mensura o RNA mensageiro (mRNA) presente nas células. Consiste na obtenção de um DNA complementar (cDNA) ao RNA por meio da utilização de RNA total como molde, de uma enzima transcriptase reversa, de um oligonucleotídeo iniciador (primer oligo dT ou primer hexâmero randômico) e de dNTPs.

- Nested-PCR: amplificação do DNA-alvo em duas etapas, de maneira a aumentar a especificidade da reação. Na primeira PCR, são usados primers externos que flanqueiam o DNA-alvo; na segunda reação, o produto de amplificação da primeira reação é utilizado como DNA-alvo para primers internos.

- Pré-amplificação do DNA: aumento da quantidade global de DNA pela utilização de oligonucleotídeos degenerados específicos (degenerate oligonucleotide-primed PCR ou DOP-PCR) ou inespecíficos (primer extension preamplification ou PEP), em reação com anelamento a baixas temperaturas.

Avanços recentes na biologia molecular fornecem ferramentas para a promoção do melhoramento genético animal. Em embriões bovinos, as principais aplicações das técnicas de biologia molecular são para:

- Sexagem. A sexagem foi a primeira técnica comercial de seleção de embriões e envolve a utilização da PCR para a co-amplificação de uma seqüência autossômica (amplificada em machos e em fêmeas) e de um fragmento gênico específico do cromossomo Y (amplificado só em machos). Por meio dessa técnica, é possível identificar e selecionar embriões machos (XY) e embriões fêmeas (XX) com acurácia de até 98%. Na produção animal, o diagnóstico precoce do sexo do concepto, por meio da sexagem, permite a seleção da progênie para o sexo desejado e orienta os esquemas de acasalamento levando ao maior aproveitamento do potencial de machos e de fêmeas de mérito genético elevado.

- Detecção de patógenos. A transferência de embriões requer rígido controle sanitário, a fim de evitar que doenças sejam transmitidas do embrião para a fêmea receptora e, posteriormente, disseminadas para o rebanho. Em bovinos, a biologia molecular tem sido utilizada para a avaliação da contaminação de embriões por vírus, como o vírus da diarréia bovina (BVDV), o herpesvírus bovino tipo 1 (BHV) e o vírus da imunodeficiência bovina (BIV).

- Determinação da viabilidade embrionária. O potencial de desenvolvimento de um embrião pode ser determinado pela avaliação, por meio de RT-PCR, do padrão de expressão de genes essenciais para o desenvolvimento, como os relacionados ao estresse oxidativo e ao estresse térmico.

- Seleção assistida por marcadores moleculares (MAS). Programas tradicionais de melhoramento genético têm buscado a seleção de animais para características de interesse comercial. No entanto, ao se basearem, principalmente, em testes de progênie, os resultados desses programas demoram a ser alcançados. Por outro lado, com o advento das técnicas de biologia molecular, vários testes tornaram possível a classificação dos animais em momentos precoces do desenvolvimento, durante a fase embrionária, de maneira que só os embriões de elevado mérito genético sejam transferidos para fêmeas receptoras. Assim, esses testes tornaram possível o estabelecimento de critérios para a identificação e a seleção mais rápidas dos animais portadores de características de interesse comercial, de maneira a diminuir o intervalo entre gerações e reduzir os custos do processo de reprodução. Nos embriões, são avaliados polimorfismos em genes importantes para a produção de leite ou de carne, como κ-caseina, β-lactoglobulina, hormônio do crescimento, prolactina, calpastatina, calpaína, leptina e tireoglobulina.

- Detecção de mutações. Os testes de biologia molecular têm sido realizados em embriões para a detecção de mutações que levam a patologias, como a deficiência de adesão leucocitária bovina (BLAD), a malformação vertebral complexa (CVM) e a citrulinemia, e permitem a eliminação precoce de animais portadores de doenças.

- Testes de paternidade. A acurada identificação do parentesco é de extrema importância para a aplicação de programas de transferência de embriões, em nível nacional e internacional. Assim, técnicas de biologia molecular permitem assegurar que um determinado embrião é realmente descendente do touro e da vaca utilizados para a transferência de embriões.

- Transferência gênica ou transgênese. A transgênese é a transferência e a incorporação permanente, que pode ser transmitida aos descendentes, de genes no genoma de um indivíduo a fim de modificar suas características físicas. Na produção animal, a transgênese é utilizada para aumentar a qualidade e a quantidade da produção, conferir resistência a doenças ou produzir proteínas de alto valor na glândula mamária ou em outros órgãos (os animais tornam-se biorreatores). Entretanto, essa metodologia ainda é limitada devido a dificuldades técnicas.

Mesmo com todas essas aplicações, ainda há limitações quanto à utilização da biologia molecular em embriões. Um dos maiores desafios é a necessidade de realização de biópsia do embrião para a avaliação do DNA ou do RNA. A biópsia deve ser realizada sem prejuízo ao desenvolvimento embrionário e, por esse motivo, necessita da utilização de equipamentos adequados e de mão-de-obra especializada. Além disso, a baixa quantidade de RNA e de DNA presentes no fragmento removido durante a biópsia requer que técnicas mais sensíveis de biologia molecular sejam desenvolvidas e aplicadas.

Por Simone Cristina Méo Niciura
Pesquisadora em Genética Molecular Animal
Embrapa Pecuária Sudeste
Rodovia Washington Luiz, km 234, CEP 13560-970, São Carlos, SP
simone@cppse.embrapa.br


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